摘要：
單細(xì)胞組學(xué)提供有關(guān)單個(gè)細(xì)胞的未稀釋信息，例如轉(zhuǎn)錄水平和高度可變蛋白質(zhì)的序列。 RNase H 依賴性 PCR 啟用的 T 細(xì)胞受體測(cè)序 (rhTCRseq) 允許對(duì) TCR 域異質(zhì)性進(jìn)行高效和高度特異性的分析，以表征免疫反應(yīng)。試驗(yàn)小型化有助于將分析縮小到單細(xì)胞水平，而不會(huì)降低靈敏度或數(shù)據(jù)質(zhì)量。小型化的關(guān)鍵要求是小體積液體處理，而這是人工無法有效完成的，需要自動(dòng)化。本應(yīng)用說明介紹了使用 MANTIS® 液體分配器構(gòu)建質(zhì)量與從大量 RNA 中構(gòu)建相媲美的 rhTCRseq cDNA 文庫。
 
介紹：
我們用核糖核酸酶 H 依賴性 PCR 啟用的 T 細(xì)胞受體測(cè)序 (rhTCRseq) 來進(jìn)行單細(xì)胞 TCR 庫分析。與從總 RNA 文庫制備中重建 TCR 相比，該方法更加精簡，提高了獲取配對(duì) TCR 亞基（α 和 β）異質(zhì)性信息的成功率，并確保了整個(gè)互補(bǔ)決定區(qū) 3 (CDR3) 的恢復(fù)。
rhTCRseq 使用高度特異性的 PCR 來實(shí)現(xiàn)從 TCR mRNA 中靶向擴(kuò)增 α- 和 β- CDR3 片段。依靠 RNase H 在 PCR 過程中配對(duì)時(shí)原位生成功能性引物大大提高了該方法的特異性，同時(shí)減少了引物二聚體形成和脫靶擴(kuò)增。工作流程（圖 1）開始于我們將單個(gè)細(xì)胞分類到微孔板中，然后是裂解、cDNA 文庫生成、TCR 特異性擴(kuò)增、對(duì)混合樣本進(jìn)行第二次 PCR 以創(chuàng)建測(cè)序文庫和測(cè)序。
   
此前，Trombetta 等人開發(fā)了一種用于 96 孔格式的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序的協(xié)議。通過將 384 孔板中的實(shí)驗(yàn)小型化來開發(fā) rhTCRseq 實(shí)驗(yàn)方案，將所需樣品體積減少了十倍。
試驗(yàn)小型化有幾個(gè)好處，包括提高靈敏度、減少樣品量、提高數(shù)據(jù)質(zhì)量和提高通量，同時(shí)降低成本和減少廢物產(chǎn)生。然而，試驗(yàn)小型化的一個(gè)挑戰(zhàn)是準(zhǔn)確和精確地分配小體積試劑。為了解決這個(gè)問題，Dana-Farber 癌癥研究所的研究人員使用 MANTIS 液體分配器在 384 孔板中將單細(xì)胞 rhTCRseq 試驗(yàn)小型化。
MANTIS 是一種自動(dòng)化、非接觸式、高精度的液體分配器，具有極低的死體積（圖 2）。 其獨(dú)特的基于隔膜的微流體泵被我們稱為“芯片”，它可以分配最低 100 nL 的體積，CV 值低于 3%。用戶可以通過將充滿試劑的移液器吸頭直接插入芯片來提供試劑，從而將死體積減少到幾微升。 MANTIS 兼容最多 1536 孔的任何板密度，并且能夠?qū)⑷魏误w積分配到任何孔中。它的芯片可以處理從 1 cP（類似水）到 25 cP（相當(dāng)于室溫下 70% 的甘油溶液）的粘度。 所有這些特性使 MANTIS 非常適合單細(xì)胞組學(xué)。本應(yīng)用說明展示了構(gòu)建高質(zhì)量 cDNA 文庫以對(duì)單細(xì)胞 T 細(xì)胞受體 mRNA 進(jìn)行高效測(cè)序的工作流程。

材料和方法：  

1. 將單個(gè)細(xì)胞分選到 Twin.tec 384 孔 PCR 板（Eppendorf）中。
2. 使用 MANTIS 分液器 (FORMULATRIX)，將裂解混合物 (1 μL) 分配到板的每個(gè)孔中。
3. 將微孔板轉(zhuǎn)移到熱循環(huán)儀中，并以以下方案運(yùn)行：50 °C 30 分鐘，72 °C 5 分鐘和 4 °C（保持）。
4. 使用 MANTIS 將 RT 混合物 (1 μL) 分配到板的每個(gè)孔中。
5. 熱循環(huán)執(zhí)行如下：42 °C 90 分鐘，70 °C 10 分鐘，和 4 °C（保持）。
6. 使用 MANTIS，將 PCR 混合物 (8 μL) 分配到板的每個(gè)孔中。
7. 將板轉(zhuǎn)移至熱循環(huán)儀，并執(zhí)行以下 PCR 方案：

1. 使用 1 mL 移液器吸頭作為儲(chǔ)液器，然后使用 MANTIS 將 11 μL ProNex 珠子 (Promega)分配至板的每個(gè)孔中。
2. 將微孔板在室溫下培養(yǎng) 10 分鐘。
3. 將微孔板置于 MagnaBot 384 磁力分離臺(tái) (Promega) 上直至溶液澄清。使用 8 通道移液器移去上清液。
4. 使用 MANTIS，在每個(gè)孔中分配 30 μL 洗滌緩沖液。
5. 洗滌并風(fēng)干微珠后，使用 MANTIS 將 17 μL 洗脫緩沖液添加到每個(gè)孔中。
6. 將板在室溫下培養(yǎng) 5 分鐘。
7. 將微孔板置于 MagnaBot 384 上直至溶液澄清，并將 15 μL 上清液從每個(gè)孔轉(zhuǎn)移到新板中。
8. 使用 2100 生物分析儀 (Agilent) 確定純化的 cDNA 文庫的質(zhì)量和數(shù)量。

 
結(jié)果：
單細(xì)胞 cDNA 文庫每次運(yùn)行的平均濃度介于 0.5 和 6.1 ng/μl 之間。單細(xì)胞 cDNA 文庫的平均片段大小約為 2000 bp，很少或沒有小于 400 bp 的物種（圖 3，紅色軌跡）。 Trombetta 等人針對(duì) 96 孔板中的 Smart-Seq2 單細(xì)胞 cDNA 文庫報(bào)告了類似的結(jié)果。 這表明在 384 孔板中使用小型化方案不會(huì)影響 cDNA 文庫中的片段分布。
來自 384 個(gè)單細(xì)胞池的最終 rhTCRseq 文庫的生物分析儀軌跡顯示 260–400 bp 的片段（圖 3，藍(lán)色軌跡）。 在使用散裝 RNA 制備的 rhTCRseq 文庫中觀察到類似的片段大�。▓D 3，綠色跡線）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，基于單細(xì)胞的小型化方案產(chǎn)生的結(jié)果可與大量 RNA 方法相媲美。
 
   
總結(jié)：
rhTCRseq 的單細(xì)胞 RNA-seq 文庫制備規(guī)模已成功縮小 10 倍。 由此產(chǎn)生的全尺寸 cDNA 文庫片段大小分布與先前報(bào)告的數(shù)據(jù)一致。 最終的 rhTCRseq 文庫片段分布在由大量 RNA 生成的文庫和 384 個(gè)單細(xì)胞之間是相似的。我們得出結(jié)論，RNAseq 反應(yīng)的小型化不會(huì)影響文庫的質(zhì)量或靈敏度。雖然小型化對(duì)液體處理提出了嚴(yán)格的要求，但這項(xiàng)工作表明 Mantis 非常適合中等通量 RNAseq 和類似組學(xué)應(yīng)用的小型化。