影響因子17.52

研究背景
肺腺癌（LUAD）的發(fā)展被認(rèn)為是從原位腺癌進(jìn)展到微創(chuàng)腺癌（MIA），最終發(fā)展到完全浸潤性腺癌（IA）的。由于MIA的惰性生長模式和良好預(yù)后，手術(shù)切除被認(rèn)為是治療MIA的首選。隨著靶向治療和免疫療法的發(fā)展，使癌癥死亡率進(jìn)一步降低成為可能。然而，這些療法對MIA的療效尚不確定，目前它們不是治療MIA的首選。這突顯了解碼MIA分子性質(zhì)的緊迫性，為這些治療提供合理的支持。

同時(shí)，有研究指出腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境（TME）的異質(zhì)性在塑造腫瘤行為中起著至關(guān)重要的作用。因此，解碼MIA中腫瘤細(xì)胞與TME之間復(fù)雜的相互作用對于更好地了解維持MIA惰性本質(zhì)和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制至關(guān)重要。

研究目的
隨著單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）的出現(xiàn)，已有研究已經(jīng)揭示了MIA和IA之間癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境（TME）轉(zhuǎn)錄組的顯著差異，但由于患者之間的巨大差異，研究結(jié)果仍然存在不一致。這種現(xiàn)象的主要原因在于LUAD的進(jìn)展受到多種因素的影響，包括遺傳和表觀遺傳特征、環(huán)境暴露、生活方式習(xí)慣、整體健康狀況等等。因此，本研究旨在消除這些混淆變量，探索 MIA腫瘤細(xì)胞性質(zhì)，揭示TEM在其中的影響，從而為MIA和LUAD的治療發(fā)展提供新的生物學(xué)基礎(chǔ)。

研究結(jié)果
1. 對MIA和IA的腫瘤和免疫生態(tài)系統(tǒng)的scRNA-seq分析
本研究收集了三名未經(jīng)治療的原發(fā)性LUAD患者的MIA和IA標(biāo)本以及非腫瘤組織（N）和PBMC樣本，用于scRNA-seq。通過Seurat進(jìn)行細(xì)胞分類和標(biāo)記基因鑒定，并用UMAP方法進(jìn)行了可視化，研究者將這些組織中的細(xì)胞簇歸類到了10個(gè)主要的已知細(xì)胞譜系中，包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。從中發(fā)現(xiàn)，非免疫細(xì)胞的比例，主要包括上皮細(xì)胞粘附分子+ （EpCAM+）上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，從N到MIA和IA樣本逐漸增加。其中，MIA中的非免疫細(xì)胞主要是內(nèi)皮細(xì)胞（76%），而在IA中，它們大多是惡性上皮細(xì)胞（97%）。而免疫細(xì)胞的比例，MIA和N中分布相當(dāng)，主要包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞。但在IA內(nèi)部，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的比率超過了前者兩個(gè)，而NK細(xì)胞的比率有所下降。此外，與前三種組織相比，PBMC顯示出免疫細(xì)胞組成很獨(dú)特，主要是由T細(xì)胞組成。

為了深入了解不同階段LUAD之間的分子變異，研究還對N、MIA和IA組織之間的基因表達(dá)譜進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIA與N之間差異表達(dá)基因（DEG）的數(shù)量與IA與MIA之間以及IA與N之間DEG的數(shù)量相比顯著減少。這表明MIA的基因表達(dá)譜更像N，而不是IA。此外，與N相比，在IA中上調(diào)的DEG主要存在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，而在MIA中上調(diào)的DEG主要存在于成纖維細(xì)胞中。以上結(jié)果表明，MIA和非腫瘤組織（N）具有相似的免疫生態(tài)系統(tǒng)，但與IA有著明顯的區(qū)別。
 

2. MIA惡性細(xì)胞的標(biāo)志性特征的探索
接下來，研究者重點(diǎn)關(guān)注了N、MIA和IA組織中上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征。通過比較它們的拷貝數(shù)變異（CNVs），可以發(fā)現(xiàn)MIA組織的CNV較低，表明MIA組織尚未完全表現(xiàn)出惡性特征。另外，又根據(jù)它們的主要標(biāo)記基因?qū)⒄�常�?xì)胞簇分為5種不同的正常細(xì)胞類型：肺泡I型細(xì)胞（AT1）、Club/Clara細(xì)胞、肺泡II型細(xì)胞（AT2）、纖毛氣道上皮細(xì)胞（Ciliated）和基底細(xì)胞（Basal）。從中可以發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞簇在患者之間是共享的，而惡性細(xì)胞簇則隨著患者的不同而變化，這突顯了惡性細(xì)胞特有的跨患者異質(zhì)性。同時(shí)也可看出，源于MIA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征與源于正常組織的細(xì)胞更相似，而和源于IA的細(xì)胞差別較大。MIA的惡性細(xì)胞數(shù)量相對有限，主要由兩個(gè)細(xì)胞簇組成：乙醛脫氫酶3家族成員A1+（ALDH3A1+，C3）和補(bǔ)體C1q A鏈+（C1QA+，C15）細(xì)胞，這些細(xì)胞簇參與抗原處理和呈遞。相比之下，在IA中沒有出現(xiàn)主要的惡性細(xì)胞簇。此外，這些不同惡性細(xì)胞簇的生物過程和信號通路表現(xiàn)出顯著的差異。
 

接下來，研究者利用Monocle3的分析發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞可能來自AT1、AT2和基底細(xì)胞。這三種細(xì)胞類型雖然起源不同，但在惡性腫瘤的后期過程中卻有著相似的演變路徑。同時(shí)，從中也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)介于基底細(xì)胞和惡性細(xì)胞之間的中間細(xì)胞狀態(tài)，它僅由來自MIA的細(xì)胞組成。這個(gè)亞簇包括來自不同患者的細(xì)胞，因此可以排除潛在的跨患者異質(zhì)性對演變路徑的影響。根據(jù)它們的擬時(shí)序，這些上皮細(xì)胞被分為九個(gè)階段，其中與MIA特異階段相關(guān)（第2階段）的獨(dú)特標(biāo)記物也通過 “‘FindAllMarkers”’函數(shù)被分析確定了，分別為水通道蛋白1（AQP1）和血管緊張素II受體類型2（AGTR2）。與IA和N相比，這些基因在MIA上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。通過調(diào)查AQP1和AGTR2在該研究scRNA-seq數(shù)據(jù)和一項(xiàng)公開的scRNA-seq數(shù)據(jù)中所有細(xì)胞類型的表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)幾乎所有同時(shí)表達(dá)AQP1和AGTR2的細(xì)胞都屬于上皮細(xì)胞。此外，這種高表達(dá)主要見于來自MIA樣本的細(xì)胞。這說明，AQP1和AGTR2的組合能夠有效地將MIA細(xì)胞與IA細(xì)胞區(qū)分開來。隨后，研究者試圖將這兩個(gè)標(biāo)記物應(yīng)用于來自The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫的LUAD隊(duì)列，以區(qū)分具有MIA特征的肺癌患者與其他患者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)標(biāo)記物成對共表達(dá)，并且其表達(dá)水平呈正相關(guān)。而且，高AQP1表達(dá)（AQP1+）和AGTR2表達(dá)(AGTR+)的患者比例在LUAD的T1階段比晚期（T4）顯著更高，這表明AQP1+AGTR2+的組合具有區(qū)分LUAD患者早期和晚期的高能力。此外，我們將T1階段中高AQP1+AGTR2+表達(dá)的患者定義為具有MIA特征的患者，發(fā)現(xiàn)他們與其他階段的患者相比具有更高的生存概率。研究者還用IF染色，測量了隊(duì)列中EpCAM+細(xì)胞中AQP1+和AGTR2+細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)EPCAM+細(xì)胞中AQP1+、AGTR2+和AQP1+AGTR2+細(xì)胞的比例顯著高于N和IA。以上結(jié)果表明，將AQP1和AGTR2的組合作為為MIA惡性細(xì)胞的標(biāo)志特征，能夠精確地區(qū)分MIA和IA。
 

3. MIA 中被證實(shí)存在豐富的(GZMK)+ CD8+ T 細(xì)胞
研究者對T細(xì)胞進(jìn)行了無監(jiān)督聚類，確定了13個(gè)子簇，并發(fā)現(xiàn)它們在患者之間以及IA、MIA、N和PBMC樣本內(nèi)都是一致的。同時(shí)，結(jié)果表明，在MIA的癌前階段，LUAD微環(huán)境中缺乏成熟和功能性的CD4+ T細(xì)胞。此外，PBMC顯示出CD4+ T細(xì)胞亞群的不同組成，與前三種組織明顯不同。MIA樣本中CD8+ T細(xì)胞的比例與正常樣本相當(dāng)，而IA樣本中CD8+ T細(xì)胞的比例低于MIA和正常樣本。此外，IA樣本中CD4+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比例也低于MIA和正常樣本，表明MIA的微環(huán)境具有足夠的細(xì)胞毒性，而IA的微環(huán)境的細(xì)胞毒性已經(jīng)衰竭。為了進(jìn)一步研究MIA和IA樣本中CD8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征，研究者又比較了正常、MIA和IA樣本中CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的基因表達(dá)。DEG分析顯示，與MIA和正常相比，IA中的許多基因上調(diào)，而與IA和正常相比，MIA中只有少量基因上調(diào)。KEGG分析顯示，MIA中的CD8+ CTL的特征是細(xì)胞毒性、P53和NF-κB信號通路的上調(diào)，表明這些細(xì)胞在MIA微環(huán)境中功能良好。

擬時(shí)序分析表明，CD8+ T細(xì)胞起源于幼稚CD8+ T細(xì)胞，共享相同的轉(zhuǎn)變軌跡，但在PBMC、N、MIA和IA樣本中處于不同的狀態(tài)。PBMC中的CD8+ T細(xì)胞處于軌跡的開始，其次是來自MIA的一部分CD8+ T細(xì)胞和來自N的所有CD8+ T細(xì)胞。同時(shí)，IA中的CD8+ T細(xì)胞處于晚期狀態(tài)，而MIA中的一些CD8+ T細(xì)胞處于軌跡的末端。細(xì)胞毒性和衰竭評分顯示，過渡始于幼稚CD8+T細(xì)胞，然后通過以高細(xì)胞毒性和低耗竭為特征的中間狀態(tài)，最后達(dá)到以高衰竭和低細(xì)胞毒性為特征的狀態(tài)。另外，細(xì)胞毒性標(biāo)志物GZMK的表達(dá)直到軌跡結(jié)束時(shí)才增加，這表明在MIA中存在一種特定的衰老CD8+T細(xì)胞亞群，其細(xì)胞毒性低但GZMK表達(dá)高（CytolowGZMK+），其比例明顯高于N、IA和PBMC中的比例。研究者后續(xù)又使用干擾素，確認(rèn)了組織中CD8+ T細(xì)胞中GZMK+細(xì)胞的比例，證實(shí)相較于N和IA，MIA中更高豐度的GZMK+ CD8+ T細(xì)胞亞群。以上結(jié)果表明，CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞毒性能力隨著LUAD的進(jìn)展而降低，MIA中的CD8+ T細(xì)胞由功能性T細(xì)胞和功能失調(diào)的低細(xì)胞毒性GZMK+衰老亞群組成。
 

高表達(dá)的組織蛋白酶B（CTSB）+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是LUAD MIA階段的早期應(yīng)答者scRNA-seq數(shù)據(jù)表明，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是LUAD中最豐富的免疫細(xì)胞之一。偽時(shí)序分析顯示，來自N、MIA和IA的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在早期和中期階段遵循類似的轉(zhuǎn)變軌跡，但來自N和IA的巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變軌跡在晚期階段出現(xiàn)分歧，而MIA的轉(zhuǎn)變軌跡介于上述兩者之間。這表明MIA巨噬細(xì)胞具有雙重進(jìn)化潛力。然后，GO分析進(jìn)一步表明，MIA階段成熟巨噬細(xì)胞的功能與N階段相似，但與IA階段不同。這表明N和MIA中成熟巨噬細(xì)胞之間的相似性比MIA和IA中成熟巨噬細(xì)胞之間的相似性更接近。

另外，研究確定了巨噬細(xì)胞中期的兩種關(guān)鍵類型的TAM。其中一種TAM以分泌型磷蛋白1（SPP1）的高表達(dá)為特征，被稱為SPP1+ TAM，而另一種以CTSB的高表達(dá)為特征，被稱為CTSB+ TAM。GO分析表明，SPP1+TAM的功能主要集中在抗原呈遞上，而CTSB+TAM主要參與激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路。IA 中 SPP1+ TAM 細(xì)胞的比例高于 N，但 MIA 中 SPP1+ TAM 細(xì)胞的比例并不高于 N。相比之下，IA 和 MIA 中 CTSB+ TAM 細(xì)胞的比例均顯著高于 N，表明 CTSB+ TAM 細(xì)胞而非 SPP1+ TAM 細(xì)胞在 MIA 中起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)Gyorffy校正的719例LUAD患者的綜合數(shù)據(jù)集顯示，CTSB和SPP1的高表達(dá)水平與較差的生存率顯著相關(guān)，突出了CTSB+和SPP1+ TAM在LUAD進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。后續(xù)進(jìn)一步的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了MIA和IA中CTSB+ CD68+巨噬細(xì)胞亞群的高豐度，而在N中則沒有。由此可知， MIA中CTSB+ TAM被激活，而SPP1+ TAM未被激活，這可能在LUAD早期進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。
 

4. CTSB+ TAMs在MIA中表現(xiàn)出與CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的潛在相互作用
為了探究MIA中上皮細(xì)胞、T細(xì)胞亞群和TAM之間的特定細(xì)胞間相互作用，本研究采用了配體-受體相互作用工具CellChat推斷信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， CTSB+和SPP1+ TAM在IA和MIA中都有很強(qiáng)的相互作用。而與IA不同，在MIA中，CTSB+ TAM的相互作用強(qiáng)度強(qiáng)于SPP1+ TAM，表明CTSB+ TAM在MIA起著更關(guān)鍵的作用。上皮本身以及SPP1+ TAM與上皮之間的相互作用在IA中很強(qiáng)，但在N的所有細(xì)胞類型之間都很平衡。在CD8+ CTL內(nèi)以及CTSB+ TAM與CD8+ CTL之間可以觀察到SPP1+ TAM之間的強(qiáng)相互作用。

為了確認(rèn)與CD8+CTL相關(guān)的特定信號變化，后續(xù)研究比較了CD8+CTL和其他細(xì)胞類型之間每對配體-受體之間的相互作用強(qiáng)度。我結(jié)果表明，主要組織相容性復(fù)合物I（MHC-I）在MIA中的相互作用強(qiáng)度明顯強(qiáng)于IA和N。由CTSB+TAM和SPP1+TAM表達(dá)的MHC-I配體和受體在MIA中比IA和N中更豐富�；�于以上結(jié)果可知，隨著CTSB+TAM和CD8+CTL之間相互作用強(qiáng)度和相互作用頻率的增加，MIA中CTSB+TAM的也會(huì)增加。因此，CTSB+TAM可能是MIA中CD8+CTL活化的原因。
 

研究總結(jié)
本文通過使用來自同步多原發(fā)LUAD患者的MIA和IA樣本，提供了MIA和IA之間腫瘤生態(tài)系統(tǒng)聯(lián)系和異質(zhì)性的新證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，與MIA和IA相比，PBMC內(nèi)細(xì)胞群的亞型和數(shù)量存在顯著差異。因此，使用PBMC樣本在臨床環(huán)境中評估LUAD的可行性仍需要進(jìn)一步調(diào)查和評估。另外，研究確認(rèn)了免疫和腫瘤表型的差異，包括細(xì)胞類型和比例、癌癥細(xì)胞的獨(dú)特特征、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的發(fā)育軌跡，以及腫瘤和免疫細(xì)胞之間的串?dāng)_。MIA腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出AQP1和AGTR2的高表達(dá)以及基底樣分子特征。同時(shí)，在MIA中，CTSB+ TAM可能會(huì)過度激活CD8+ T細(xì)胞，導(dǎo)致GZMK+衰老CD8+ T細(xì)胞富集，表明MIA的惰性外觀下可能存在惡性進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)可以成為理論依據(jù)，加深對維持MIA惰性特征和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制的理解，并協(xié)助開發(fā)更有效的治療靶點(diǎn)和策略，以治療MIA患者。

原文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202303753

關(guān)于臨床樣本的單細(xì)胞懸液制備
目前，隨著單細(xì)胞RNA測序技術(shù)（scRNA-seq）在生物研究中的普及，其在各類臨床樣本中也得到了廣泛的應(yīng)用。本研究憑借該技術(shù)，完成了對通過對LUAD 中不同階段組織樣本的轉(zhuǎn)錄組分析，從而確認(rèn)了該疾病中細(xì)胞類型和比例、癌癥細(xì)胞的獨(dú)特特征、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的發(fā)育軌跡，以及腫瘤和免疫細(xì)胞之間的相互作用。為了能盡可能完整地保留這些臨床樣本中的信息，一套合適、完善的單細(xì)胞懸液制備方案必不可少。

伯豪生物為此研究中的scRNA-seq提供了技術(shù)服務(wù)。我們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)?wèi){借著大量的經(jīng)驗(yàn)積累，不斷創(chuàng)新樣本存儲(chǔ)和處理技術(shù)，自主研發(fā)了20余種樣本保存、處理試劑。結(jié)合肺癌組織的樣本特征和研究目標(biāo)，我們優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方案，成功協(xié)助研究團(tuán)隊(duì)完成了這項(xiàng)研究。

考慮到臨床樣本在獲取后難以快速開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如何合理地保存組織樣本，保證細(xì)胞活性便成為最先需要關(guān)注的問題。同時(shí)，為了最大限度獲取各類細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)，選擇恰當(dāng)?shù)姆绞綄�樣本進(jìn)行解離也是其中的關(guān)鍵步驟。而由伯豪生物獨(dú)立研究開發(fā)的伯優(yōu)系列產(chǎn)品成功為克服這些困難提供了解決方案。

本次研究中，我們使用了伯優(yōu)®單細(xì)胞測序組織保存液和伯優(yōu)®組織樣本懸液制備試劑。

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結(jié)果參考

伯優(yōu)®組織樣本懸液制備試劑盒適用于人和常見模式動(dòng)物的多種類型樣本的單細(xì)胞懸液制備，通過預(yù)處理組織并進(jìn)行酶解，組織 上的細(xì)胞會(huì)最大限度的被解離下來，經(jīng)過過篩收集和離心等步驟，可高效獲得目的樣本的單細(xì)胞懸液。該試劑盒累計(jì)成功制備80余種組織類型的細(xì)胞懸液，細(xì)胞活力平均90%以上。

結(jié)果參考

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