隨著越來越多的生物制品進(jìn)入治療領(lǐng)域，該類制品的質(zhì)量控制也日趨嚴(yán)格，其中核酸殘留一項(xiàng)是各類質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的重中之重，因?yàn)镈NA的穩(wěn)定性，容易在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生殘留，而這些生物制品應(yīng)用到人類疾病治療時(shí)，會帶來不可控危險(xiǎn)因素。終產(chǎn)品的宿主核酸殘留量必須遵循WHO、FDA和EMEA以及我國NMPA監(jiān)管條例。尤其近年來包括大牌進(jìn)口產(chǎn)品在內(nèi)的狂犬疫苗DNA殘留超標(biāo)問題，引起了社會和業(yè)界的廣泛關(guān)注。
 

生產(chǎn)生物制品的宿主細(xì)胞多是連續(xù)傳代細(xì)胞(continuouscelllines, CCLs)，其調(diào)控生長的基因失靈，而擁有無限增殖的能力，CCLs的殘留DNA可能使人體細(xì)胞生長失控，變成腫瘤細(xì)胞。所以需要嚴(yán)格控制生物制品的殘余DNA，避免這種風(fēng)險(xiǎn)危害。1984年的國際會議上采納了殘余DNA的臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)，即來自CCLs的生物制品DNA殘留不能超過10pg/人份劑量。1986年WHO的會議指出殘余宿主DNA的主要風(fēng)險(xiǎn)與其潛在致瘤活性有關(guān)。
 

此外，殘余DNA中可能存在感染性病毒基因組，病毒基因組能夠擴(kuò)增并產(chǎn)生感染性病毒粒子。體外實(shí)驗(yàn)表明，1pg逆轉(zhuǎn)錄病毒的前病毒DNA就具有感染性。有些殘留DNA可能攜帶HIV病毒或者Ras致癌基因，DNA感染性風(fēng)險(xiǎn)可能比致瘤風(fēng)險(xiǎn)更高。
 

另外，有學(xué)者認(rèn)為，接種幾十針疫苗后，其殘余的DNA累積可能具有其他潛在危害：未發(fā)生降解的外源DNA，在哺乳細(xì)胞基因LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子作用下有插入細(xì)胞基因組的可能性，帶來其他潛在風(fēng)險(xiǎn)。
 

而且，由于微生物來源的基因組DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重組蛋白藥物在體內(nèi)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，可能增加體內(nèi)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA抗體。
 

因此從安全角度，在生物制品的生產(chǎn)工藝中必須有去除DNA的步驟，并進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證。有研究采用病毒DNA定量感染的方法評價(jià)DNA的滅活程度，采用逐典全能核酸酶可消除其感染活性。WHO和各國藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)一般控制100pg/每劑量的殘留DNA，特殊情況下最高允許10ng/劑量。
 

我國部分疫苗及治療用生物制品殘留DNA標(biāo)準(zhǔn)（中國藥典2015）

我國參照WHO、FDA和歐盟標(biāo)準(zhǔn)，很早就對生物制品中殘余DNA含量進(jìn)行限制。從衛(wèi)生部頒布的《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點(diǎn)》到近年的《中國生物制品規(guī)程》和藥典，都對DNA殘留做了嚴(yán)格要求，部分標(biāo)準(zhǔn)高于國際標(biāo)準(zhǔn)。美國藥典2015版（USP38-NF33）中增加了新的章節(jié)（General Chapter<30>）來進(jìn)一步規(guī)范殘留DNA的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。新版USP中將唯一推薦qPCR法作為生物制品中的宿主殘留DNA檢測方法。
 

此外，在CAR-T細(xì)胞治療中，病毒包裝后的核酸去除也是必要質(zhì)量控制，必須保證回輸?shù)募?xì)胞足夠純，減低風(fēng)險(xiǎn)和危害。
 

除卻生物制品中必須要去除核酸殘留，在平常的蛋白提取、生化分析樣品回收中，核酸殘留的影響也是非常大的，有效去除核酸殘留，可明顯降低細(xì)胞裂解液粘度，提高蛋白得率，蛋白生化分析中也可提高分辨率，并提高回收率。
 

在核酸殘留去除工作中，難點(diǎn)是由于DNA帶有大量的電荷易與其他生物大分子結(jié)合從而產(chǎn)生聚集（吸附）、包裹作用而難以完全除去。傳統(tǒng)的方法均存在低含量核酸殘留去除不凈、工作量大耗時(shí)長的致命缺陷，全能核酸酶可完美解決此類難點(diǎn)。
 

常用核酸去除方法

參考文獻(xiàn)

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