熒光技術(shù)的原理及其在顯微鏡領(lǐng)域的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1643　發(fā)布日期：2024-1-15　來(lái)源：徠卡顯微鏡

熒光是George Gabriel Stokes于1852年首次報(bào)道的一種現(xiàn)象。他觀察到螢石在紫外線照射后開(kāi)始發(fā)光。熒光是光致發(fā)光的一種形式，是指一種材料被光照射后會(huì)發(fā)射出光子。發(fā)射光的波長(zhǎng)比激發(fā)光更長(zhǎng)。這種效應(yīng)又稱(chēng)為斯托克斯位移。

以熒光為工具在顯微鏡中的應(yīng)用

熒光在顯微鏡中有著廣泛的應(yīng)用，是觀察特定分子分布的重要工具。細(xì)胞中的絕大多數(shù)分子并不會(huì)發(fā)出熒光，因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于感興趣的分子可以直接標(biāo)記（例如，用DAPI標(biāo)記DNA），或者使用可與特異性抗體偶聯(lián)的熒光素進(jìn)行免疫染色。免疫染色時(shí)通常必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。

熒光顯微鏡還可對(duì)活細(xì)胞或組織進(jìn)行延時(shí)成像。為此，對(duì)于感興趣的蛋白質(zhì)可以使用基因編碼的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記，如GFP（綠色熒光蛋白）。對(duì)于感興趣的分子（如Ca2+）還可以使用可逆結(jié)合的合成染料（如fura-2）或轉(zhuǎn)基因天然蛋白質(zhì)（如GFP衍生物）進(jìn)行標(biāo)記。

圖1：當(dāng)特定波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)）的光照射到分子上（例如照射到熒光團(tuán)中）時(shí)，光子會(huì)被分子的電子吸收。然后，電子從它們的基態(tài)(S0)提升到更高的能級(jí)，即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為激發(fā)(1)。激發(fā)態(tài)壽命很短(通常為10-9/-10-8秒)，在此期間電子的一些能量會(huì)丟失(2)。當(dāng)電子離開(kāi)激發(fā)態(tài)(S1)返回基態(tài)(3)時(shí)，它們會(huì)失去在激發(fā)過(guò)程中獲得的剩余能量。熒光團(tuán)的獲得的能量會(huì)以光子形式釋放，釋放的光子波長(zhǎng)以比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，從而能量更少。這種現(xiàn)象被稱(chēng)為斯托克斯位移。

圖2：COS 7細(xì)胞，綠色：無(wú)特征蛋白質(zhì)，GFP，紅色：α-微管蛋白，Cy3，藍(lán)色：細(xì)胞核，DAPI。感謝中國(guó)上海SIBS、CAS、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所邊瑋提供的圖片。

圖3：小鼠成纖維細(xì)胞，綠色：F-肌動(dòng)蛋白，F(xiàn)ITC，紅色：微管蛋白，Cy5，藍(lán)色：細(xì)胞核，DAPI。感謝德國(guó)海德堡Max Planck醫(yī)學(xué)研究所Günter Giese博士提供的圖片。

圖4：小鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，藍(lán)色：轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記；綠色：肌動(dòng)蛋白，TRITC；紅色：GluA Ampa受體單位，Texas Red；灰色：突觸小泡蛋白，Cy 5

圖5：果蠅幼蟲(chóng)，綠色：RNA結(jié)合蛋白，Alexa 488

磷光的機(jī)制原理

由于磷光分子發(fā)光的時(shí)間比熒光素長(zhǎng)得多，因此它們儲(chǔ)存激發(fā)能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎(chǔ)在于兩種形式的激發(fā)能級(jí)，即單重激發(fā)態(tài)和三重激發(fā)態(tài)都基于不同的自旋排列。

自旋是電子的一種屬性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，自旋描述了由電子旋轉(zhuǎn)引起的角動(dòng)量。電子的自旋方向可以是正方向（+1/2），也可以是負(fù)方向（−1/2）。更高能級(jí)的自旋配對(duì)可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配對(duì)中，單個(gè)角動(dòng)量相互補(bǔ)償，同時(shí)自旋總值為零。這種自旋排列就稱(chēng)為單重態(tài)。兩種平行自旋互不補(bǔ)償且所得數(shù)值不同于零值，在這種情況下，自旋被稱(chēng)為三重態(tài)。

當(dāng)電子從單重態(tài)激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生熒光。但在某些分子中，被激發(fā)電子的自旋可以在一種稱(chēng)為系統(tǒng)間交叉的過(guò)程中轉(zhuǎn)換為三重態(tài)。這些電子失去能量，直到它們處于三重基態(tài)。這種態(tài)比基態(tài)具有更高的能量，但也比單重態(tài)激發(fā)態(tài)具有更低的能量。因此，電子無(wú)法切換回單重態(tài)，也不能輕易地返回基態(tài)，因?yàn)榱孔恿W(xué)只允許自旋總值為零。因此分子被困在其能量狀態(tài)當(dāng)中。

但從三重基態(tài)到基態(tài)的一些變化有時(shí)還是有可能的。這些變化會(huì)發(fā)射出光子和磷光。由于一次只有少數(shù)事件可能發(fā)生，三重基態(tài)呈現(xiàn)為能量?jī)?chǔ)庫(kù)的形式，因此能夠在更長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)發(fā)出磷光。

冷發(fā)光在顯微鏡中的應(yīng)用

對(duì)于顯微鏡，熒光是最為實(shí)用的一種冷發(fā)光。熒光素可以很容易地通過(guò)特定的光源（如燈和濾光系統(tǒng)或激光器）在特定波長(zhǎng)下激發(fā)，發(fā)射光和激發(fā)光可以通過(guò)波長(zhǎng)來(lái)加以區(qū)分（斯托克斯位移）。

利用熒光成像，實(shí)驗(yàn)室人員可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子數(shù)量和位置進(jìn)行特征描述。熒光顯微鏡的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使用幾種熒光素。熒光素只需其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不同即可。因此，不同目標(biāo)分子均可同時(shí)觀察并開(kāi)展大量的實(shí)驗(yàn)，例如開(kāi)展共定位的研究等。

圖6：果蠅，幼蟲(chóng)齡期，綠色：Feb211陽(yáng)性神經(jīng)元及其軸突，Alexa 488；紅色：CNS纖維部分（即所有軸突），Cy3；藍(lán)色：細(xì)胞核，DAPI。感謝德國(guó)Eggenstein-Leopoldshafen毒理學(xué)與遺傳基因研究所，Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的圖片。

圖7：小鼠腎臟切片，綠色：腎小球和腎曲小管，Alexa 488 WGA；紅色：F-肌動(dòng)蛋白（普遍存在于腎小球和刷狀緣）；藍(lán)色：細(xì)胞核，DAPI

圖8：新生心肌細(xì)胞，黃色：DNA，DAPI；綠色：肌間蛋白，Cy3；紅色：鈣粘蛋白，Texas Red；藍(lán)色：肌動(dòng)蛋白，Alexa 633

圖9：熒光顯微鏡下獲得的分裂中期FISH染色染色體。感謝東京大學(xué)前沿科學(xué)研究生院人類(lèi)進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室Yumiko Suto博士提供的圖片。