目前，100%的病死率和病毒株的交叉感染使ASFV對(duì)社會(huì)的危害不斷擴(kuò)大。由于缺乏有效的商業(yè)疫苗，早期發(fā)現(xiàn)是遏制ASFV感染的最有效手段。
近期，山東師范大學(xué)在Biosensors and Bioelectronics發(fā)表了一篇《Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor》，該文章報(bào)告了一個(gè)基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)結(jié)合石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器的級(jí)聯(lián)檢測(cè)平臺(tái)。
CRISPR-Cas12a級(jí)聯(lián)平臺(tái)的工作原理是基于RNA導(dǎo)向的DNA切割機(jī)制，通過選擇性識(shí)別和切割特定的DNA序列，實(shí)現(xiàn)基因組的精確編輯。具體來說，在缺乏目標(biāo)DNA的情況下，crRNA與Cas12a結(jié)合形成RNP。當(dāng)crRNA識(shí)別目標(biāo)DNA時(shí)，CRISPR-Cas12a的非特異性DNA切割活性被激活。
為了提高信號(hào)產(chǎn)生的效率，該平臺(tái)采用了特殊的報(bào)告探針(RP)設(shè)計(jì)，由靠近石墨烯的6T和遠(yuǎn)離石墨烯的12U組成。這種設(shè)計(jì)使得如果一個(gè)脫氧核糖核苷酸被降解，至少有12個(gè)核苷酸會(huì)從石墨烯表面分離，顯著提高信號(hào)產(chǎn)生效率。然而，該級(jí)聯(lián)平臺(tái)中的RP被固定在石墨烯表面，替代傳統(tǒng)RP傳感器通常分散在溶液系統(tǒng)中，這使得RP可以被激活的CRISPR-Cas12a更強(qiáng)烈地降解。     另外，這個(gè)平臺(tái)還采用了ASFV P72基因中的10個(gè)crRNA特異性位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)ASFV更靈敏的檢測(cè)。這些crRNA可以識(shí)別不同的位點(diǎn)，并激活Cas12a蛋白的剪切活性。通過在單個(gè)長(zhǎng)靶上設(shè)置多個(gè)可以識(shí)別不同位點(diǎn)的crRNA，可以顯著提高靶向Cas12a蛋白的激活效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Real-time熒光檢測(cè)限為100 fM，靈敏度不足以實(shí)現(xiàn)ASFV病毒檢測(cè)的臨床應(yīng)用。因此，探索如何使CRISPR-Cas12a系統(tǒng)對(duì)ASFV檢測(cè)更加靈敏是必要的，并成為研究熱點(diǎn)。
接著，作者對(duì)不同條件下的電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)表明：石墨烯的電導(dǎo)率對(duì)外源摻雜敏感，經(jīng)PBASE處理的石墨烯與RP/PBASE處理的石墨烯差異較大，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更容易識(shí)別。    
  緊接著，作者測(cè)試了該平臺(tái)的檢測(cè)靈敏度與特異性，發(fā)現(xiàn)ASFV-P72基因在0.1 aM ~ 100 aM濃度范圍內(nèi)通過級(jí)聯(lián)平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，成功檢測(cè)到濃度低至0.5 aM的靶標(biāo)，高于Real-time PCR的最低檢測(cè)限10aM。且除ASFV外，所有病毒均引起狄拉克斑點(diǎn)向左移動(dòng)，顯示了級(jí)聯(lián)平臺(tái)的特異性。    
 
最后，作者對(duì)12例ASFV陽性樣本和4例陰性樣本進(jìn)行傳感器檢測(cè)，陽性樣本出現(xiàn)高強(qiáng)度右移特征響應(yīng)，表明平臺(tái)具有良好可靠性；陰性樣本出現(xiàn)左移狄拉克點(diǎn)變化響應(yīng)，表明平臺(tái)具有良好的特異性。與已發(fā)表的研究成果相比，該平臺(tái)對(duì)ASFV臨床樣本的檢測(cè)時(shí)間最短，靈敏度最高。采用4個(gè)ASFV模擬樣本進(jìn)行分型試驗(yàn)，當(dāng)模擬樣品中僅存在P72基因時(shí)，添加新的crRNA不會(huì)改變斜率；當(dāng)存在CD2V基因時(shí)，添加crRNA-CD2V會(huì)增加斜率；同樣，當(dāng)存在MGF基因時(shí)，添加crRNA-MGF也會(huì)導(dǎo)致斜率增大。通過觀察特定應(yīng)變類型的crRNA加入后斜率是否發(fā)生變化，成功進(jìn)行了應(yīng)變分型。    
   
點(diǎn)評(píng)：該級(jí)聯(lián)平臺(tái)可在30分鐘內(nèi)檢測(cè)到低至0.5 aM的ASFV，并在單一檢測(cè)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)ASFV野生株和疫苗株的分型。對(duì)16份臨床樣本的評(píng)價(jià)證明，該平臺(tái)與金標(biāo)準(zhǔn)Real-time PCR方法相比，靈敏度、特異性和分型方面具有突出的優(yōu)勢(shì)。該級(jí)聯(lián)平臺(tái)結(jié)合CRISPR/Cas12a的高特異性和石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管的雙極電場(chǎng)效應(yīng)，與已發(fā)表的研究成果相比，本文提出的傳感器對(duì)ASFV臨床樣本的檢測(cè)時(shí)間最短，靈敏度最高，有望在DNA疾病檢測(cè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)臨床應(yīng)用，為多品系疾病分型提供新的方向。    

文章來源：Wang H, Sun Y, Zhou Y, et al. Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor. Biosens Bioelectron. 2023;240:115637. doi:10.1016/j.bios.2023.115637