標(biāo)記和修飾抗體的蛋白質(zhì)交聯(lián)新方法Buccutite共軛法研究
簡(jiǎn) 介
兩個(gè)大生物分子間的共價(jià)結(jié)合，是研究人員的一項(xiàng)重要任務(wù)，例如酶的抗體或DNA的酶。有多種可用于交聯(lián)兩種生物分子的方法，其中最常見的方法，就是使用小交聯(lián)劑（如磺化SMCC）。SMCC一端具有胺反應(yīng)的NHS脂與蛋白質(zhì)的游離胺（-NH2）反應(yīng)，另一端具有巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基與生物分子的巰基（-SH）反應(yīng)。SMCC修飾的蛋白質(zhì)接頭是非常不穩(wěn)定的，通常是自反應(yīng)的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常含有游離胺和巰基，導(dǎo)致大量的同位交聯(lián)。另外，蛋白質(zhì)上馬來酰亞胺基團(tuán)數(shù)目的定量是繁瑣的，而且很難確定兩個(gè)生物分子在反應(yīng)中聯(lián)接的合適的摩爾比以達(dá)到理想的功能和偶聯(lián)效率。
現(xiàn)在，有一種簡(jiǎn)單有效的交聯(lián)方法，將兩個(gè)高共軛率的生物分子連接起來。該方法使用兩種獨(dú)特的交聯(lián)劑（Buccutite MAT和Buccutite FOL）。MAT和FOL蛋白的交聯(lián)劑易于控制和量化。經(jīng)過脫鹽柱去除游離連接物后，Buccutite MAT激活的抗體和Buccutite FOL修飾的蛋白質(zhì)在溫和條件下混合后易發(fā)生反應(yīng)。從本質(zhì)上講，這種純化是不必要的，而且在反應(yīng)中沒有同位交聯(lián)的生物分子。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交聯(lián)方法
材料和方法
抗體和酶：山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG來自Jacksonm免疫研究實(shí)驗(yàn)室，HRP來自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb來自Life Technologies.
凈化柱：所有的凈化柱都來自Bio-Rad的Bio-Spin尺寸排除柱。
細(xì)胞成像：Hela細(xì)胞用4%甲醛固定，用小鼠抗微管蛋白染色，然后用HPR-Goat-Anti-Mouse lgG綴合物染色。用Olympus IX71熒光顯微鏡成像。
共軛原理
1.用MAT激活山羊抗小鼠lgG，用FOL（1小時(shí)）修飾標(biāo)簽蛋白（APC或PE）。
2.用旋轉(zhuǎn)柱（5min）對(duì)激活的lgG5和修飾的標(biāo)記蛋白進(jìn)行純化。
3.將活化的抗體和修飾的標(biāo)記蛋白混合30分鐘。
4.用所需的共軛物染色細(xì)胞，無需純化。
抗體蛋白質(zhì)結(jié)合過程
結(jié) 果
用于ELISA檢測(cè)的HRP-lgG共軛物
用Buccutite交聯(lián)技術(shù)（紅色）和SMCC方法（藍(lán)色）制備HPR-山羊-抗小鼠lgG共軛物，產(chǎn)生直接ELISA曲線。將小鼠單克隆抗體（100ng）包被在96孔板上，用標(biāo)準(zhǔn)方法將GAM lgG-HRP共軛物稀釋為2倍稀釋系列。使用ABTS底物溶液（#11001）檢測(cè)30分鐘并在405nm讀取的固定化小鼠lgG.
用于細(xì)胞成像的lgG-RPE共軛物
在Hela細(xì)胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物對(duì)微管蛋白進(jìn)行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗體對(duì)微管蛋白進(jìn)行染色，并如上所述用Buccutite交聯(lián)技術(shù)制備的紅色熒光RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物顯現(xiàn)。
結(jié) 論
1.連接器非常穩(wěn)定。Buccutite接頭激活的大分子非常穩(wěn)定，可以在4℃下儲(chǔ)存超過24個(gè)月。
2.共軛條件是非常溫和和強(qiáng)大的。Buccutite結(jié)合物可以在PH、濃度和溫度范圍內(nèi)運(yùn)行，不需要催化劑。
3.高效率：Buccutite共軛可在1小時(shí)內(nèi)完成。在相同條件下，Buccutite共軛法比其他現(xiàn)有的方法具有更高的產(chǎn)率，共軛可以在極低的濃度下進(jìn)行。
兩個(gè)大生物分子間的共價(jià)結(jié)合，是研究人員的一項(xiàng)重要任務(wù)，例如酶的抗體或DNA的酶。有多種可用于交聯(lián)兩種生物分子的方法，其中最常見的方法，就是使用小交聯(lián)劑（如磺化SMCC）。SMCC一端具有胺反應(yīng)的NHS脂與蛋白質(zhì)的游離胺（-NH2）反應(yīng)，另一端具有巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基與生物分子的巰基（-SH）反應(yīng)。SMCC修飾的蛋白質(zhì)接頭是非常不穩(wěn)定的，通常是自反應(yīng)的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常含有游離胺和巰基，導(dǎo)致大量的同位交聯(lián)。另外，蛋白質(zhì)上馬來酰亞胺基團(tuán)數(shù)目的定量是繁瑣的，而且很難確定兩個(gè)生物分子在反應(yīng)中聯(lián)接的合適的摩爾比以達(dá)到理想的功能和偶聯(lián)效率。
現(xiàn)在，有一種簡(jiǎn)單有效的交聯(lián)方法，將兩個(gè)高共軛率的生物分子連接起來。該方法使用兩種獨(dú)特的交聯(lián)劑（Buccutite MAT和Buccutite FOL）。MAT和FOL蛋白的交聯(lián)劑易于控制和量化。經(jīng)過脫鹽柱去除游離連接物后，Buccutite MAT激活的抗體和Buccutite FOL修飾的蛋白質(zhì)在溫和條件下混合后易發(fā)生反應(yīng)。從本質(zhì)上講，這種純化是不必要的，而且在反應(yīng)中沒有同位交聯(lián)的生物分子。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交聯(lián)方法
材料和方法
抗體和酶：山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG來自Jacksonm免疫研究實(shí)驗(yàn)室，HRP來自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb來自Life Technologies.
凈化柱：所有的凈化柱都來自Bio-Rad的Bio-Spin尺寸排除柱。
細(xì)胞成像：Hela細(xì)胞用4%甲醛固定，用小鼠抗微管蛋白染色，然后用HPR-Goat-Anti-Mouse lgG綴合物染色。用Olympus IX71熒光顯微鏡成像。
共軛原理
1.用MAT激活山羊抗小鼠lgG，用FOL（1小時(shí)）修飾標(biāo)簽蛋白（APC或PE）。
2.用旋轉(zhuǎn)柱（5min）對(duì)激活的lgG5和修飾的標(biāo)記蛋白進(jìn)行純化。
3.將活化的抗體和修飾的標(biāo)記蛋白混合30分鐘。
4.用所需的共軛物染色細(xì)胞，無需純化。
抗體蛋白質(zhì)結(jié)合過程
結(jié) 果
用于ELISA檢測(cè)的HRP-lgG共軛物
用Buccutite交聯(lián)技術(shù)（紅色）和SMCC方法（藍(lán)色）制備HPR-山羊-抗小鼠lgG共軛物，產(chǎn)生直接ELISA曲線。將小鼠單克隆抗體（100ng）包被在96孔板上，用標(biāo)準(zhǔn)方法將GAM lgG-HRP共軛物稀釋為2倍稀釋系列。使用ABTS底物溶液（#11001）檢測(cè)30分鐘并在405nm讀取的固定化小鼠lgG.
用于細(xì)胞成像的lgG-RPE共軛物
在Hela細(xì)胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物對(duì)微管蛋白進(jìn)行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗體對(duì)微管蛋白進(jìn)行染色，并如上所述用Buccutite交聯(lián)技術(shù)制備的紅色熒光RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物顯現(xiàn)。
結(jié) 論
1.連接器非常穩(wěn)定。Buccutite接頭激活的大分子非常穩(wěn)定，可以在4℃下儲(chǔ)存超過24個(gè)月。
2.共軛條件是非常溫和和強(qiáng)大的。Buccutite結(jié)合物可以在PH、濃度和溫度范圍內(nèi)運(yùn)行，不需要催化劑。
3.高效率：Buccutite共軛可在1小時(shí)內(nèi)完成。在相同條件下，Buccutite共軛法比其他現(xiàn)有的方法具有更高的產(chǎn)率，共軛可以在極低的濃度下進(jìn)行。
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