AbMole以其卓越的品質(zhì)、與時(shí)俱進(jìn)的產(chǎn)品、專業(yè)無(wú)憂的服務(wù)，不斷鼎力支持全球科學(xué)家獲得重要的突破性成果。
 

來(lái)自中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的Chao Chen和Xinjian Li 等多名研究人員在Cell Metab期刊（IF=29）上，發(fā)表了題為“ABCG2 is an itaconate exporter that limits antibacterial innate immunity by alleviating TFEB-dependent lysosomal biogenesis”的研究成果，該研究使用了購(gòu)自AbMole的Bis(sulfosuccinimidyl) suberate(BS3，M9872)，并揭示了ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 G2（ABCG2）是一種衣康酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，能將衣康酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而抑制衣康酸誘導(dǎo)的TFEB活化和溶酶體生成，最終抑制先天免疫抗菌防御能力。
 

衣康酸是一種由免疫應(yīng)答基因1(IRG1)對(duì)TCA循環(huán)中間產(chǎn)物順烏頭酸進(jìn)行脫羧而合成的代謝產(chǎn)物，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，從而在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用。然而，衣康酸從巨噬細(xì)胞中排出的機(jī)制仍不清楚。
 

研究人員通過(guò)構(gòu)建gRNA 文庫(kù)進(jìn)行CRISPR-Cas9 篩選，并在篩選的結(jié)果中，將 ABCG2 作為潛在的衣康酸輸出體進(jìn)行進(jìn)一步研究。
 

隨后研究人員敲除了THP-1 細(xì)胞和永生化小鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞（iBMDMs）中的 ABCG2/Abcg2。免疫印跡和生化分析結(jié)果表明，在 LPS 刺激下，ABCG2/Abcg2 基因敲除（KO）不會(huì)改變IRG1的水平，但是細(xì)胞內(nèi)衣康酸水平升高，而培養(yǎng)上清液中的衣康酸水平下降，提示 ABCG2 能促進(jìn)衣康酸從 LPS 激活的巨噬細(xì)胞中輸出。
 

接下來(lái)通過(guò)引入點(diǎn)突變，削弱 ABCG2 介導(dǎo)的 ATP 水解活性。生化分析表明ABCG2 ATP水解缺失突變體的重組表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)衣康酸水平升高，培養(yǎng)上清液中衣康酸水平下降。然后研究人員通過(guò)測(cè)定野生型和ATP 水解缺陷突變體在脂質(zhì)體中重組后的體外ATP酶和衣康酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性，發(fā)現(xiàn) ABCG2 的轉(zhuǎn)運(yùn)活性依賴于水解ATP。
 

之前的研究發(fā)現(xiàn)，衣康酸能通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子 TFEB誘導(dǎo)溶酶體生成。在本研究中，免疫熒光和細(xì)胞分餾分析等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ABCG2/Abcg2 KO或 ABCG2 ATP水解缺陷突變體的重組表達(dá)能促進(jìn) LPS 刺激的TFEB 核易位，促進(jìn)溶酶體基因表達(dá)和溶酶體區(qū)室的形成。
 

此外，免疫印跡分析和ELISA結(jié)果表明，ABCG2/Abcg2的缺失，在LPS刺激下會(huì)升高NRF2和ATF3的蛋白水平，抑制IL-1b 分泌。同時(shí)，ASC寡聚化試驗(yàn)也表明，ABCG2/Abcg2缺失會(huì)導(dǎo)致大型多聚 ASC 復(fù)合物減少，提示ABCG2 缺乏能促進(jìn)衣康酸誘導(dǎo)的溶酶體生物生成，并抑制巨噬細(xì)胞的炎癥程序激活。 
 

隨后，研究人員用鼠傷寒沙門菌（S. typhimurium）感染 THP-1 細(xì)胞和 iBMDMs，并發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌感染能以 ABCG2 依賴性方式誘導(dǎo) IRG1 表達(dá)，并且BCG2/Abcg2 KO 或 ABCG2 ATP水解缺陷突變體的重組表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌滴度下降，提示ABCG2 是巨噬細(xì)胞先天免疫抗菌防御的有效負(fù)調(diào)控因子。
 

接下來(lái)，研究人員構(gòu)建了髓細(xì)胞特異性Abcg2-KO小鼠模型，并采用鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，ABCG2 的缺失會(huì)以 IRG1 依賴性的方式促進(jìn)體內(nèi)的先天免疫抗菌防御。
 

最后，為了確定該研究結(jié)果與人類的相關(guān)性，研究人員使用人巨噬細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，生化分析和亞細(xì)胞分餾分析等研究表明，在 LPS 激活的人巨噬細(xì)胞中，ABCG2 的表達(dá)與衣康酸的輸出相關(guān)，阻斷 ABCG2 可促進(jìn) TFEB 激活和 TFEB 依賴性溶酶體生物生成。

本研究使用了購(gòu)自AbMole的Bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3，M9872)，BS3是一種活性交聯(lián)劑，常用于蛋白質(zhì)、多肽和細(xì)胞表面的交聯(lián)反應(yīng)中。它可以通過(guò)酰胺鍵結(jié)合到含有羥基、胺基或硫代基的官能團(tuán)上，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的交聯(lián)。 研究人員使用BS3交聯(lián)樣品檢測(cè) ASC 的寡聚化，從而得到了ABCG2/Abcg2缺失能導(dǎo)致大型多聚 ASC 復(fù)合物減少，并抑制巨噬細(xì)胞的炎癥程序激活的結(jié)論。

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