人呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是一種非節(jié)段性單股復鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科，肺病毒屬，肺病毒亞科，分A、B兩個亞型，呈季節(jié)性流行：A、B亞型交替或共循環(huán)。

RSV的基因組全長為15.2Kb，編碼11個病毒蛋白，其中病毒包膜上有三種蛋白：粘附蛋白G，融合蛋白F和小疏水蛋白SH。G和F蛋白在病毒感染過程中起核心作用，因此在RSV疫苗開發(fā)中，主要針對G蛋白和F蛋白開展抗原設計。

目前國內(nèi)外RSV疫苗按照研發(fā)技術路線可分為：重組減毒活病毒（LAVs）疫苗、重組亞單位疫苗、mRNA疫苗、腺病毒載體疫苗。

RSV重組減毒活病毒疫苗
與其他類型的疫苗相比，在不強制添加佐劑的情況下，重組減毒活疫苗（LAVs）誘導的免疫應答與病原體自然感染時的應答相似，從而誘導更高的免疫應答。代表性的產(chǎn)品有Blue Lake Biotechnology的BLB-201，Codagenix公司的CodaVax-RSV，Sanofi Pasteur的VAD00001等。

此類疫苗生產(chǎn)需要獲得減毒活病毒，可采用的工藝如下：

將收獲的病毒液經(jīng)過核酸酶處理和過濾澄清后，利用Diamond Layer 700填料進行純化，以高效去除宿主蛋白和核酸。此工藝具有高上樣量（可達10 CV）和高回收率（50%~60%）的優(yōu)點，確保病毒的純度和活性。

Fig. 1 RSV重組減毒活病毒獲取工藝流程

RSV重組亞單位疫苗
研發(fā)機構通常選擇RSV的G或F表面蛋白進行抗原分子設計，此類疫苗由于缺乏整個病原體的基因組，具有更高的疫苗安全性水平，適用于免疫功能低下的人群或老年人。采用G蛋白的代表如艾棣維欣，采用F蛋白的代表為GSK的Arexvy和輝瑞的雙價RSV疫苗Abrysvo。

以制備F蛋白為例，可采用以下工藝過程：

經(jīng)CHO細胞培養(yǎng)，收獲上清并澄清，第一步層析為親和填料Diamond Viru-S對RSV Pre F蛋白捕獲和提純，宿主蛋白流穿。

第二步使用高分辨陰離子交換填料Diamond Q Mustang層析，采用結合洗脫模式進一步去HCP和HCD等雜質。

第三步層析可使用復合模式填料Diamond MIX-A結合模式，實現(xiàn)產(chǎn)品相關雜質和痕量宿主蛋白的去除。

隨后進行納濾、超濾和除菌過濾獲得抗原原液。

Fig. 2 抗原原液獲取工藝流程

RSV mRNA疫苗
mRNA作為疫苗平臺只攜帶特定蛋白的遺傳信息，由于宿主遺傳物質受到干擾和修飾的可能性較低，因此具有較高的安全性。代表性產(chǎn)品如Moderna的mRNA-1325。mRNA類疫苗工藝包括了質粒模板的制備、mRNA的合成與純化、LNP的制備及無菌灌裝等步驟。

質粒的制備工藝可以選擇經(jīng)典的三步法工藝：

Fig. 3 質粒純化三步法工藝流程

使用限制性內(nèi)切酶獲得的線性化質粒DNA，可使用Q Bestarose HP去除較大的宿主基因組DNA、質粒DNA及部分酶。

體外轉錄后的mRNA形式RSV疫苗純化，捕獲層析可選用復合模式填料Diamond Layer 700，流穿模式有效去除消化后的pDNA、酶及NTP等工藝相關雜質。

精細純化可以選擇高分辨率強陰離子交換填料如Diamond Q Mustang或BestPoly 30Q，也可以選擇高分辨率疏水填料Diamond Phenyl Mustang或Diamond Butyl Mustang，去除片段或dsRNA等產(chǎn)品相關雜質。

 

Fig. 4 mRNA形式RSV疫苗純化工藝流程

RSV病毒載體疫苗
用于RSV疫苗的病毒載體類型主要有腺病毒載體和痘病毒載體。已批準上市的腺病毒載體新冠疫苗具有較為成熟的生產(chǎn)工藝。RSV病毒載體疫苗代表性研發(fā)廠家為Janssen和Bavarian Nordic。

以腺病毒載體為例，可采用以下工藝：

HEK293細胞培養(yǎng)和病毒感染，感染結束后可以用表面活性劑對細胞進行裂解，核酸酶進行宿主核酸的降解，裂解液經(jīng)深層濾器進行澄清，再經(jīng)300 kDa的中空纖維進行濃縮及換液，而后經(jīng)過Diamond Q Mustang初步純化及Diamond Layer 700精細純化，層析后料液通過300 kDa超濾濃縮換液得到最終的疫苗原液。

 

Fig. 5 疫苗原液獲取工藝流程

相關產(chǎn)品信息