熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的常見問題及其解答
熒光實(shí)時定量 PCR 技術(shù) (real-time quantitative PCR，qPCR) 幾乎是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)中最重要、應(yīng)用最廣泛的核酸定量檢測技術(shù)。成功的定量 PCR 實(shí)驗(yàn)離不開精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作流程。
實(shí)時熒光定量 PCR 分析的部分實(shí)施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。雖然PCR實(shí)驗(yàn)操作簡單，但有時仍避免不了各種各樣的問題。下面整理了關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)中幾個常見的問題來進(jìn)行詳細(xì)解答。
01 、沒有ct值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況，排查是否有以下問題：
1)、循環(huán)數(shù)不夠（一般不超過45循環(huán)，不僅背景值提高，定量也不準(zhǔn)）；
2)、PCR程序設(shè)置錯誤，檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集，TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號，另外熒光采集是否選中；
3)、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解；
4)、模板量可能降解或上樣量不足（不超過500ng，根據(jù)試劑盒說明書即可），對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起；如果發(fā)生模板降解，應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲備，避免反復(fù)凍融；
5)、引物探針是否合適（尤其是引物跨越內(nèi)含子，以確保擴(kuò)增基因組DNA；上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增）。
02、標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳R2<0.9，很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：
1)、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；
2)、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，現(xiàn)配現(xiàn)用；
3)、引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針；
4)、模板中存在抑制物。模板濃度過高，根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以50—500ng為宜。
03、ct值過晚
在相對定量中，Ct值一般控制在15—25之間比較好，如果在絕對定量中，對低拷貝數(shù)的樣品，Ct值會增大，但是一般不宜超過40循環(huán)，否則定量不準(zhǔn)確。因此，判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況，需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1)、 擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適，需要進(jìn)行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計(jì)不合理，需要重新設(shè)計(jì)；
2)、PCR程序不合適，改用三步法進(jìn)行反應(yīng)，或者優(yōu)化退火/延伸溫度，可以適當(dāng)降低退火溫度；退火/延伸時間短（可以在推薦的時間條件下延長10s）；
3)、MgCl2 濃度不合適，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；
4)、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp；
5)、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。
04、熔解曲線峰不特異
熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：
1)、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時，適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；
2)、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。
3)、離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合，有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果；
05、陰性對照擴(kuò)增有信號
照擴(kuò)增有信號排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng)，造成交叉污染：
1)、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
2)、引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
3)、鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。
4)、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。
5)、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染，建議對操作環(huán)境進(jìn)行處理，或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
06、擴(kuò)增曲線異常
遇到擴(kuò)增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況，有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：
1)、模板的濃度太高或者降解；
2)、熒光染料的降解；
3)、在操作熒光定量PCR時，帶上新的一次性手套，蓋上避免任何指紋或者字跡等；
4)、液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā)，沒有很好的聚集在管子里；
5)、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。
07、擴(kuò)增效率低
該情況適用于針對所有的基因，特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴(kuò)增信號時，應(yīng)考慮如下情況：
1)、反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；
2)、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化�？蛇m當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法，適當(dāng)延長變性退火時間；
3)、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時所引入的，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系，減少抑制物的影響。
實(shí)時熒光定量 PCR 分析的部分實(shí)施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。雖然PCR實(shí)驗(yàn)操作簡單，但有時仍避免不了各種各樣的問題。下面整理了關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)中幾個常見的問題來進(jìn)行詳細(xì)解答。
01 、沒有ct值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況，排查是否有以下問題：
1)、循環(huán)數(shù)不夠（一般不超過45循環(huán)，不僅背景值提高，定量也不準(zhǔn)）；
2)、PCR程序設(shè)置錯誤，檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集，TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號，另外熒光采集是否選中；
3)、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解；
4)、模板量可能降解或上樣量不足（不超過500ng，根據(jù)試劑盒說明書即可），對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起；如果發(fā)生模板降解，應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲備，避免反復(fù)凍融；
5)、引物探針是否合適（尤其是引物跨越內(nèi)含子，以確保擴(kuò)增基因組DNA；上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增）。
02、標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳R2<0.9，很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：
1)、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；
2)、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，現(xiàn)配現(xiàn)用；
3)、引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針；
4)、模板中存在抑制物。模板濃度過高，根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以50—500ng為宜。
03、ct值過晚
在相對定量中，Ct值一般控制在15—25之間比較好，如果在絕對定量中，對低拷貝數(shù)的樣品，Ct值會增大，但是一般不宜超過40循環(huán)，否則定量不準(zhǔn)確。因此，判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況，需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1)、 擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適，需要進(jìn)行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計(jì)不合理，需要重新設(shè)計(jì)；
2)、PCR程序不合適，改用三步法進(jìn)行反應(yīng)，或者優(yōu)化退火/延伸溫度，可以適當(dāng)降低退火溫度；退火/延伸時間短（可以在推薦的時間條件下延長10s）；
3)、MgCl2 濃度不合適，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；
4)、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp；
5)、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。
04、熔解曲線峰不特異
熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：
1)、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時，適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；
2)、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。
3)、離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合，有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果；
05、陰性對照擴(kuò)增有信號
照擴(kuò)增有信號排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng)，造成交叉污染：
1)、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
2)、引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
3)、鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。
4)、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。
5)、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染，建議對操作環(huán)境進(jìn)行處理，或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
06、擴(kuò)增曲線異常
遇到擴(kuò)增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況，有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：
1)、模板的濃度太高或者降解；
2)、熒光染料的降解；
3)、在操作熒光定量PCR時，帶上新的一次性手套，蓋上避免任何指紋或者字跡等；
4)、液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā)，沒有很好的聚集在管子里；
5)、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。
07、擴(kuò)增效率低
該情況適用于針對所有的基因，特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴(kuò)增信號時，應(yīng)考慮如下情況：
1)、反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；
2)、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化�？蛇m當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法，適當(dāng)延長變性退火時間；
3)、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時所引入的，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系，減少抑制物的影響。
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