PCR反應(yīng)條件及循環(huán)參數(shù)論述
PCR反應(yīng)在生物體外大量擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其特點(diǎn)是可以以微量的DNA為模板，快速擴(kuò)增得到大量拷貝。
一、PCR反應(yīng)條件的控制：
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應(yīng)溫度
（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。
二、PCR的循環(huán)參數(shù)：
1. 預(yù)變性（Initial denaturation）
模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。
退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
6. 最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
一、PCR反應(yīng)條件的控制：
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應(yīng)溫度
（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。
二、PCR的循環(huán)參數(shù)：
1. 預(yù)變性（Initial denaturation）
模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。
退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
6. 最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
- NHS活性酯熒光標(biāo)記詳細(xì)步驟、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案指南
- 腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)和藥敏篩選中細(xì)胞因子和抑制劑的種類(lèi)及作用
- 不同類(lèi)型小分子抑制劑和人源化單抗在腫瘤干細(xì)胞與免疫研究中的應(yīng)用
- 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）操作技巧匯總
- TROP2蛋白的組成、信號(hào)通路及其在癌癥和藥物中的作用
- 根據(jù)熔解曲線(xiàn)與Ct值評(píng)價(jià)qPCR實(shí)驗(yàn)成功與否的方法
- GMP小分子在細(xì)胞治療中的作用和應(yīng)用前景
- 脂質(zhì)納米顆粒LNP的組成特點(diǎn)、應(yīng)用及其制備方法
- 2024年"MCE中國(guó)生命科學(xué)研究促進(jìn)獎(jiǎng)"評(píng)獎(jiǎng)結(jié)果公布
- 陶術(shù)生物直播預(yù)告：受體藥理學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)研究
- 安捷倫免疫組化法PD-L1檢測(cè)試劑盒獲得歐盟IVDR認(rèn)證
- 德國(guó)Massive Photonics推出多款DNA-PAINT各系試劑盒
- 天隆自主研發(fā)HCV核酸檢測(cè)試劑盒獲批藥監(jiān)局三類(lèi)NMPA
- 蘭博利德推出新品高保真快速擴(kuò)增 PCR mix試劑盒
- IPHASE邀您共赴BIOCHINA2025第十屆易貿(mào)生物產(chǎn)業(yè)大會(huì)
- 2025年廣西臨床檢驗(yàn)儀器、試劑與輸血用品展通知
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話(huà)：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com