實驗操作分享之從分子克隆到細胞轉(zhuǎn)染全解析
產(chǎn)品體驗官
瑞沃德「 細胞與分子生物新星創(chuàng)作計劃 」火熱進行中，我們將不定期刊登入選文章，給廣大細胞分子科研工作者提供一個展示、交流和學習的平臺。
另外，本期投稿活動的獎品除了拍立得、藍牙降噪耳機外，新增《黑神話：悟空》游戲激活碼作為基本獎勵的獎品（耳機與游戲任選一）。
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從分子克隆到細胞轉(zhuǎn)染全解析
通過表達或者敲低來研究基因?qū)δ艿挠绊懯羌毎飳W中常用的手段，熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)也為研究追蹤細胞動態(tài)和變化提供了有效的工具。因此將某個基因引入細胞系，或者細胞系中敲除/敲低某個基因不可避免地需要經(jīng)過轉(zhuǎn)染這個過程。功能完整的質(zhì)粒需要從分子克隆開始小心的設計，避免造成功能元件的缺失或者artifacts。本文從分子克隆開始講述如何構(gòu)建一個在哺乳動物細胞中正常表達的質(zhì)粒，以及如何將該質(zhì)粒遞送（轉(zhuǎn)染）到細胞系中。
分子克隆
分子克隆的目的是把自己想要表達的基因安裝在表達載體上，這樣表達載體轉(zhuǎn)染進細胞后可以啟動目的基因的表達。因此，表達載體或質(zhì)粒，需要包含必須的幾個原件來啟動目的基因的表達，同時方便細胞轉(zhuǎn)染后的篩選。
質(zhì)粒的基本組成部分
完整的質(zhì)粒通常包括：啟動子（promoter, 用以啟動目的基因的表達），目的基因(GOI)，終止子（terminator or polyA, 用以終止基因的表達），復制起始位點（ori, 用來質(zhì)粒的擴增，真核表達載體有的含有兩個復制起始位點包含質(zhì)粒在大腸桿菌中擴增的ori和f1 ori），抗性基因（用來在大腸桿菌和細胞中篩選陽性克�。�。有的真核細胞表達載體還含有其他原件，用來增強基因表達過程中的穩(wěn)定性（如AAV載體中的WPRE），方便病毒包裝（AAV和lenti載體中的兩端重復序列），控制多個基因表達（IRES和P2A元件等）。有的還會同時表達熒光蛋白方便后期細胞的篩選。經(jīng)典的質(zhì)粒圖譜如下（由SnapGene生成）：
分子克隆
分子克隆類似于打補丁，把其他地方得到的目的基因通過PCR或者酶切的方式得到，并粘貼到一個需要的表達載體上。因此整個過程設計PCR，酶切，片段回收，連接轉(zhuǎn)化，測序，質(zhì)粒擴增和抽提。簡短的示意圖以Takara的In Fusion為例：
1 PCR
PCR的目的是為了得到可以用來連接的目的基因，通過兩端引物的擴增得到自己想要的目的序列，在這個過程中可以通過引物的設計添加或者刪除酶切位點，引入突變位點等。需要注意的是，如今市面上多種多樣的高保真酶可以確保堿基突變的概率很低，甚至可以用這些高保真酶擴增長片段，高GC，多序列重復的載體序列。
2 酶切
得到的PCR產(chǎn)物需要插入到自己的表達載體上，通常質(zhì)粒為超螺旋閉環(huán)狀，因此需要合適的限制性內(nèi)切酶切開對應位點，以方便目的基因的插入。切開的質(zhì)粒通常需要回收骨架部分，舍棄掉原來位置上的基因。建議使用NEB家的限制性內(nèi)切酶，沒有星號活性，Buffer基本通用，可以靈活的調(diào)節(jié)和控制酶切反應及時間。對于沒有想要的酶切位點的載體，可以利用步驟1中的PCR方式獲取。
3 片段回收
為了獲得高純度，去除反應液中的離子，通常需要DNA瓊脂糖凝膠電泳來回收酶切或PCR得到的目的基因和載體（膠回收）。通常最后的洗脫用去離子水或者雙蒸水，以方便下一步的使用。
4 連接轉(zhuǎn)化
常用的分子克隆手段有很多，如普通的酶切連接（依賴T4 DNA 連接酶），In Fusion (依賴于外切酶)，GoldenGate (依賴TypeIIS型限制性內(nèi)切酶創(chuàng)造的獨特切口），Gibson組裝（外切酶，聚合酶，連接酶同時作用），CPEC（高保真DNA聚合酶）等。連接轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物通常轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，以獲得單克隆。
5 測序
重組得到的單克隆菌落有的時候會有錯配或者突變，堿基的缺失等，因此需要挑選單克隆菌落測序。通常測序前會通過菌落PCR和酶切驗證，但是如前所說，現(xiàn)在的DNA高保真聚合酶大大減少了突變的發(fā)生，而目前的連接方法組裝正確率都很高，因此為節(jié)約時間，我選擇平板隨機挑選兩個菌落送測。
6 質(zhì)粒擴增和抽提
測序成功的質(zhì)�？梢灾匦罗D(zhuǎn)化感受態(tài)，挑取單克隆培養(yǎng)后選擇小提/中提/大提質(zhì)粒。值得注意的是，用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒最好使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取盒。
轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前的準備
轉(zhuǎn)染之前需要準備細胞，一般細胞復蘇后傳1-2代觀察形態(tài)和狀態(tài)，如果條件嚴格的話還需要檢查是否有支原體污染或者黑膠蟲等。細胞狀態(tài)良好的，形態(tài)完整活力較好的，匯合度達到80-90%后可以接種細胞。接種細胞前需要計數(shù)，有條件的推薦RWD家的細胞計數(shù)儀。以293T為例一個示意的形態(tài)圖(匯合度>90%)和細胞狀態(tài)如下：
▲ 10倍鏡下狀態(tài)
轉(zhuǎn)染
經(jīng)典的轉(zhuǎn)染方式包括磷酸鈣，脂質(zhì)體（以Thermo的lipo2000/3000為代表），PEI （25, 0000 or 40, 000），慢病毒侵染等，每周轉(zhuǎn)染方式大同小異，具體原理就不一一贅述。以下以經(jīng)濟實用的PEI轉(zhuǎn)染為例：
1 準備試劑
無血清培養(yǎng)基(DMEM or opti-MEM), PEI (1mg/mL)，待轉(zhuǎn)染的DNA質(zhì)粒。
2 準備DNA-PEI復合物
以24孔板為例，500ng的DNA稀釋到50ul的無血清培養(yǎng)基中，然后按1：3（1μg DNA : 3μL PEI）的比例加入PEI （需要自己調(diào)試PEI的比例1：1-1：5，和細胞類型和不停品牌的PEI質(zhì)量都有一定關(guān)系），混勻后靜止15min，一次性將復合物滴入到待轉(zhuǎn)染的孔。
3（可選）
6-8小時后去除培養(yǎng)基，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS）。
4 24小時后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果
通常轉(zhuǎn)染效率很高，大于90%：
總結(jié)
現(xiàn)在的分子克隆和細胞轉(zhuǎn)染的教程很多，而且很多商家的產(chǎn)品都會有詳細的介紹，從原理到具體操作。本人推薦常用到的幾個網(wǎng)站和學習資源，如SnapGene，Addgene, Takara官網(wǎng)，Thermo和NEB，F(xiàn)uGENE, ATCC。他們基本上是分子和細胞領(lǐng)域的權(quán)威和產(chǎn)品創(chuàng)新者，很多國內(nèi)的產(chǎn)品都是在此基礎上做出來的平替。這些網(wǎng)站無論是在宣傳還是產(chǎn)品介紹上都給出了很權(quán)威且詳細的介紹。
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從分子克隆到細胞轉(zhuǎn)染全解析
分子克隆
質(zhì)粒的基本組成部分
完整的質(zhì)粒通常包括：啟動子（promoter, 用以啟動目的基因的表達），目的基因(GOI)，終止子（terminator or polyA, 用以終止基因的表達），復制起始位點（ori, 用來質(zhì)粒的擴增，真核表達載體有的含有兩個復制起始位點包含質(zhì)粒在大腸桿菌中擴增的ori和f1 ori），抗性基因（用來在大腸桿菌和細胞中篩選陽性克�。�。有的真核細胞表達載體還含有其他原件，用來增強基因表達過程中的穩(wěn)定性（如AAV載體中的WPRE），方便病毒包裝（AAV和lenti載體中的兩端重復序列），控制多個基因表達（IRES和P2A元件等）。有的還會同時表達熒光蛋白方便后期細胞的篩選。經(jīng)典的質(zhì)粒圖譜如下（由SnapGene生成）：
分子克隆
分子克隆類似于打補丁，把其他地方得到的目的基因通過PCR或者酶切的方式得到，并粘貼到一個需要的表達載體上。因此整個過程設計PCR，酶切，片段回收，連接轉(zhuǎn)化，測序，質(zhì)粒擴增和抽提。簡短的示意圖以Takara的In Fusion為例：
1 PCR
PCR的目的是為了得到可以用來連接的目的基因，通過兩端引物的擴增得到自己想要的目的序列，在這個過程中可以通過引物的設計添加或者刪除酶切位點，引入突變位點等。需要注意的是，如今市面上多種多樣的高保真酶可以確保堿基突變的概率很低，甚至可以用這些高保真酶擴增長片段，高GC，多序列重復的載體序列。
2 酶切
得到的PCR產(chǎn)物需要插入到自己的表達載體上，通常質(zhì)粒為超螺旋閉環(huán)狀，因此需要合適的限制性內(nèi)切酶切開對應位點，以方便目的基因的插入。切開的質(zhì)粒通常需要回收骨架部分，舍棄掉原來位置上的基因。建議使用NEB家的限制性內(nèi)切酶，沒有星號活性，Buffer基本通用，可以靈活的調(diào)節(jié)和控制酶切反應及時間。對于沒有想要的酶切位點的載體，可以利用步驟1中的PCR方式獲取。
3 片段回收
為了獲得高純度，去除反應液中的離子，通常需要DNA瓊脂糖凝膠電泳來回收酶切或PCR得到的目的基因和載體（膠回收）。通常最后的洗脫用去離子水或者雙蒸水，以方便下一步的使用。
4 連接轉(zhuǎn)化
常用的分子克隆手段有很多，如普通的酶切連接（依賴T4 DNA 連接酶），In Fusion (依賴于外切酶)，GoldenGate (依賴TypeIIS型限制性內(nèi)切酶創(chuàng)造的獨特切口），Gibson組裝（外切酶，聚合酶，連接酶同時作用），CPEC（高保真DNA聚合酶）等。連接轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物通常轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，以獲得單克隆。
5 測序
重組得到的單克隆菌落有的時候會有錯配或者突變，堿基的缺失等，因此需要挑選單克隆菌落測序。通常測序前會通過菌落PCR和酶切驗證，但是如前所說，現(xiàn)在的DNA高保真聚合酶大大減少了突變的發(fā)生，而目前的連接方法組裝正確率都很高，因此為節(jié)約時間，我選擇平板隨機挑選兩個菌落送測。
6 質(zhì)粒擴增和抽提
測序成功的質(zhì)�？梢灾匦罗D(zhuǎn)化感受態(tài)，挑取單克隆培養(yǎng)后選擇小提/中提/大提質(zhì)粒。值得注意的是，用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒最好使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取盒。
轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染之前需要準備細胞，一般細胞復蘇后傳1-2代觀察形態(tài)和狀態(tài)，如果條件嚴格的話還需要檢查是否有支原體污染或者黑膠蟲等。細胞狀態(tài)良好的，形態(tài)完整活力較好的，匯合度達到80-90%后可以接種細胞。接種細胞前需要計數(shù)，有條件的推薦RWD家的細胞計數(shù)儀。以293T為例一個示意的形態(tài)圖(匯合度>90%)和細胞狀態(tài)如下：
▲ 10倍鏡下狀態(tài)
轉(zhuǎn)染
經(jīng)典的轉(zhuǎn)染方式包括磷酸鈣，脂質(zhì)體（以Thermo的lipo2000/3000為代表），PEI （25, 0000 or 40, 000），慢病毒侵染等，每周轉(zhuǎn)染方式大同小異，具體原理就不一一贅述。以下以經(jīng)濟實用的PEI轉(zhuǎn)染為例：
1 準備試劑
無血清培養(yǎng)基(DMEM or opti-MEM), PEI (1mg/mL)，待轉(zhuǎn)染的DNA質(zhì)粒。
2 準備DNA-PEI復合物
以24孔板為例，500ng的DNA稀釋到50ul的無血清培養(yǎng)基中，然后按1：3（1μg DNA : 3μL PEI）的比例加入PEI （需要自己調(diào)試PEI的比例1：1-1：5，和細胞類型和不停品牌的PEI質(zhì)量都有一定關(guān)系），混勻后靜止15min，一次性將復合物滴入到待轉(zhuǎn)染的孔。
3（可選）
6-8小時后去除培養(yǎng)基，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS）。
4 24小時后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果
通常轉(zhuǎn)染效率很高，大于90%：
▲ 瑞沃德細胞計數(shù)儀，5倍鏡下狀態(tài)
總結(jié)
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