細(xì)胞鋪板是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的第一步，將細(xì)胞鋪得均勻、密度適宜是對(duì)于確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和可信服性具有不可替代的作用。接下來(lái)隨小 M 一起看看細(xì)胞鋪板有哪些秘密訣竅呢~

細(xì)胞鋪板是細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)起始的重要步驟，可以說(shuō)是引領(lǐng)著一個(gè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵！其基本原理是將一定數(shù)量的細(xì)胞均勻，密度合適的接種到培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，以便后續(xù)進(jìn)行一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
 

圖 1. 實(shí)驗(yàn)流程和操作步驟。 
（Created with BioRender.com）

無(wú)論是藥物篩選、基因表達(dá)研究還是細(xì)胞信號(hào)通路分析，細(xì)胞鋪板都是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵步驟。正確的細(xì)胞鋪板可以確保細(xì)胞的健康生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，從而獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
 
01
細(xì)胞鋪板實(shí)驗(yàn)

一、準(zhǔn)備工作

1. 實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，完全培養(yǎng)基，PBS，胰酶，移液槍及槍頭等。
小貼士：完全培養(yǎng)基一般是由無(wú)血清培養(yǎng)基+胎牛血清 (FBS) +青霉素/鏈霉素雙抗組成。

2. 無(wú)菌環(huán)境：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行清潔并無(wú)菌處理，如紫外照射。

3. 培養(yǎng)基預(yù)熱：將完全培養(yǎng)基，PBS，胰酶，置于 37℃ 預(yù)熱至室溫，減少細(xì)胞冷應(yīng)激。

二、收集細(xì)胞

1. 選擇細(xì)胞：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇生長(zhǎng)速度、形態(tài)、特性等合適的細(xì)胞系或提取原代細(xì)胞。

2. 觀察細(xì)胞狀態(tài)：將細(xì)胞放置在顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)及密度。以貼壁細(xì)胞為例，若培養(yǎng)基澄清透明且無(wú)漂浮雜質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至 80-90% 密度且狀態(tài)良好時(shí)，則可以進(jìn)行細(xì)胞傳代或鋪板。

3. 細(xì)胞消化：將細(xì)胞進(jìn)行傳代，棄去培養(yǎng)基，取適量的 PBS 輕輕潤(rùn)洗 2-3 次，吸盡上清。加入適量的胰酶置于 37℃ 培養(yǎng)箱中消化 (消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型而定)，待細(xì)胞皺縮且間隙變大、可從皿底滑落且不聚團(tuán)成塊時(shí)即可加培養(yǎng)基終止消化。
小貼士：應(yīng)隨時(shí)觀察細(xì)胞消化狀態(tài)，消化時(shí)間太短或太長(zhǎng)都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)哦~

三、細(xì)胞計(jì)數(shù)

將終止消化的細(xì)胞輕輕吹打，使細(xì)胞完全從皿底脫落。將細(xì)胞懸液收集至離心管中，以 800-1000 rpm，3 min 進(jìn)行離心，棄上清。加入適量的完全培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞團(tuán)塊，輕輕吹打混勻后取 10 μL 細(xì)胞懸液與 10 μL 臺(tái)盼藍(lán)輕輕混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)鋪板密度的需要計(jì)算所需細(xì)胞懸液的體積。

四、細(xì)胞鋪板

▐ 確定鋪板密度
1. 不同孔板鋪細(xì)胞數(shù) (以 HEK 293 細(xì)胞為例) 鋪板密度

  
小貼士： 細(xì)胞密度太大容易造成細(xì)胞活性差和細(xì)胞死亡，細(xì)胞密度太小會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)物表達(dá)降低和污染風(fēng)險(xiǎn)增加。

圖 3. HT-1080 細(xì)胞鋪板 1 h 內(nèi)拍照。 
密度太大（左）和密度太�。ㄓ遥�

2. 不同直徑的細(xì)胞系鋪板密度

表 2. 不同直徑的細(xì)胞鋪板密度需求^[1]。

  小貼士：

• 接種密度：小細(xì)胞可以在相對(duì)較高的密度下生長(zhǎng)，而大細(xì)胞需要較低的密度以避免接觸抑制。

• 細(xì)胞形態(tài)：大細(xì)胞通常需要更多空間來(lái)擴(kuò)展和生長(zhǎng)。

• 時(shí)間和方法：大細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)生長(zhǎng)到可傳代的狀態(tài)。在處理和傳代時(shí)，大細(xì)胞需要更溫和以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

 
3. 實(shí)驗(yàn)類(lèi)型

表 3. 不同實(shí)驗(yàn)類(lèi)型的細(xì)胞鋪板密度需求。 

▐ 鋪板操作

確定鋪板密度后，根據(jù)自己所需的細(xì)胞量即可計(jì)算所需的細(xì)胞懸液體積。

舉個(gè)栗子：若需要 5 mL 密度為 10⁵/mL 的細(xì)胞量，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為 2×10⁶/mL，則吸取 250 μL 的細(xì)胞懸液與 4.75 mL 的完全培養(yǎng)基混合即可。

用移液槍吸取適量的細(xì)胞懸液 (避免吸取氣泡)，在培養(yǎng)皿上方豎直懸空均勻、緩慢地滴加在各個(gè)角落。蓋上培養(yǎng)皿后沿著水平桌面采用“8”字法或者“十字”形輕輕搖晃培養(yǎng)皿，重復(fù) 5-6 次確保使細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行鋪板操作^[10]。

小貼士：如何鋪的均勻？
答：“8” 字法 or 十字混勻法。

1. 96 孔板：

充分混勻細(xì)胞懸液后 (避免產(chǎn)生氣泡)，用排槍吸取計(jì)數(shù)后一定體積的細(xì)胞，槍頭與孔壁呈 45 ℃ 沿壁緩慢并均勻地將細(xì)胞懸液分配到每個(gè)孔中。若加樣孔太多，建議每鋪一部分及時(shí)混勻細(xì)胞懸液。在接種完成之后，蓋上 96 孔板，靜止 3-5 min。
 

2. 其他孔板或者培養(yǎng)皿：

• 8 字法：以 24 孔板為例，細(xì)胞鋪完后，貼著水平桌面畫(huà) “8” 字軌跡，重復(fù) 5-6 次。
• 十字混勻法：以 24 孔板為例，細(xì)胞鋪完后，貼著水平桌面先上下移動(dòng)，再左右移動(dòng)，呈十字形狀，重復(fù) 5-6 次。

小貼士：

• 搖晃過(guò)程中應(yīng)注意力度，防止培養(yǎng)基濺灑出來(lái)污染細(xì)胞哦~
• 細(xì)胞易沉降，建議每鋪一部分孔 (比如半塊板)，及時(shí)混勻預(yù)先配制的細(xì)胞懸液，然后繼續(xù)鋪板。

▐ 后續(xù)觀察

鋪完細(xì)胞后記得顯微鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞的均勻度和密度，如果你能觀察到細(xì)胞“顆粒”分明、分布均勻且密度中等，那么恭喜你，細(xì)胞鋪板工作你已經(jīng)完美結(jié)束啦~趕緊將你的細(xì)胞放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)啦！

圖 5. 成功鋪板后的 HT-1080 細(xì)胞 0 h（左）和 2 h（右）。 

最后�。。∏�萬(wàn)不要鋪完細(xì)胞就撒手不管啦~細(xì)胞也是有生命的，需要被時(shí)時(shí)“關(guān)愛(ài)”與“呵護(hù)”的哦~

• 定期使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、增殖情況。
• 記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)估實(shí)驗(yàn)效果。
• 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，適時(shí)進(jìn)行細(xì)胞處理 (如藥物添加、轉(zhuǎn)染等)，并繼續(xù)觀察細(xì)胞。

02
常見(jiàn)問(wèn)題及可能原因

一、鋪完細(xì)胞后狀態(tài)不佳

可能性原因：

1. 細(xì)胞的消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝功能；
2. 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)菌、真菌或霉菌等污染(如果細(xì)胞被支原體感染，可嘗試用支原體清除劑處理)；
3. 細(xì)胞密度過(guò)大或過(guò)小，影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；
4. 細(xì)胞吹打用力造成細(xì)胞機(jī)械損傷，影響細(xì)胞正常生命活動(dòng)；
5. 檢查培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境，確保用來(lái)鋪板的細(xì)胞傳代次數(shù)不多，細(xì)胞活力好。

二、細(xì)胞密度不均勻

可能性原因：

1. 細(xì)胞的消化時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞消化不充分或細(xì)胞結(jié)團(tuán)率太高；
2. 細(xì)胞本身性質(zhì)，偏向于成團(tuán)生長(zhǎng)，如 HepG2。

3. 計(jì)數(shù)和鋪板時(shí)，細(xì)胞重懸吹打次數(shù)太少，未充分混勻，細(xì)胞密度分布不均勻；
4. 在進(jìn)行液體分配時(shí)，技術(shù)不一致或操作不當(dāng)可能導(dǎo)致分配不均；
5. 培養(yǎng)環(huán)境中的 pH、溫度或 CO₂ 濃度等參數(shù)不適合細(xì)胞，會(huì)影響生長(zhǎng)和移動(dòng)。

三、細(xì)胞形態(tài)異常或死亡、凋亡

可能性原因：

1. 細(xì)胞密度過(guò)大或過(guò)小，過(guò)度擁擠或稀疏；
2. 培養(yǎng)條件不當(dāng)對(duì)細(xì)胞造成損傷，比如溫度、氣體成分和培養(yǎng)基；
3. 培養(yǎng)基組分出現(xiàn)過(guò)期或變質(zhì)；
4. 在重懸和鋪板過(guò)程中，強(qiáng)烈搖晃或過(guò)度機(jī)械性操作。

03
小結(jié)

除了以上的秘密小技巧外，細(xì)胞鋪板也離不開(kāi)操作手法上的經(jīng)驗(yàn)積累。希望能夠幫助到每一位科研工作者順利、圓滿(mǎn)的得到自己想要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果哦！

產(chǎn)品推薦

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3001) 適于 Hela、293、Cos-7、PC-12、原代成纖維、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、人臍帶靜脈內(nèi)皮、平滑肌等細(xì)胞

DMEM/F-12 (1:1), L-Glutamine, Phenol Red, HEPES (HY-K3002) 適于 MDCK、神經(jīng)膠質(zhì)、成纖維和人內(nèi)皮等細(xì)胞

DMEM (Low Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3003) 適于 Hela、293、Cos-7、PC-12、原代成纖維、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、人臍帶靜脈內(nèi)皮、平滑肌等細(xì)胞

RPMI 1640 (L-Glutamine, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3004) 適于 HeLa、Jurkat、 MCF-7、PC12、PBMC、星形膠質(zhì)和癌細(xì)胞等細(xì)胞

Fetal Bovine Serum (Superfine), Uruguay (HY-T1000) 特級(jí)胎牛血清

PBS Buffer (1×) (HY-K3005) PBS (1×) 磷酸鹽緩沖液

MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) (HY-K3011) MEM 非必需氨基酸溶液(100X)

L-Glutamine (100×), Sterile (HY-K1046) L-谷氨酰胺 (100×)，一種必需氨基酸

0.25% Trypsin-EDTA (1×), phenol red (HY-K3007) 適于細(xì)胞解離、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)傳代及原代組織解離

BM-Cyclin (HY-K1059) 支原體清除試劑

Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile (HY-K1006)‍ 青霉/鏈霉素雙抗溶液

參考文獻(xiàn)：
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