常見細胞污染不同情況的解決方法匯總
細胞污染是細胞培養(yǎng)實驗室中最常見的問題，有時也會造成比較嚴重的后果。細胞培養(yǎng)污染物一般可分為兩大類：一類是化學污染物，如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質，包括內毒素、增塑劑和洗滌劑；另一類是生物污染物，如細菌、霉菌、酵母、病毒和支原體，以及其他細胞系的交叉污染；雖然污染無法完全消除，但可以通過全面了解其來源并遵循良好的無菌技術，從而降低污染的發(fā)生頻率和嚴重性。
細胞污染一般可分為微生物污染和真核生物污染。其中微生物污染包括真菌和酵母、細菌、支原體等。而真核生物一般是細胞系間的交叉污染。 細胞常見的污染情況總結如下：
1、細菌污染：
細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米(μm)計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。
一旦發(fā)生細菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內顏色變黃，表明有大量酸性物質產生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結果。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。
看到這種，別猶豫了你的細胞被污染了，那么怎么辦呢，基本原則立馬扔掉，別擴大污染，如果你的細胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復沖洗幾遍，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉su、新霉su（50ug/ml）等，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。
2、真菌污染：
是細胞培養(yǎng)過程中常見的一種，尤其在梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。
真菌污染真的不建議處理，因為孢子容易飄散，可能這瓶沒9過來，又擴大了污染，建議預防為主，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅，就是藍色的那種東西。哎，如果你非救不可，可以采用兩性霉su B（0.25-2.5），三天后換液加入含PS的培養(yǎng)液。
3、支原體污染：
支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(小直徑0．2um)并生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性�？蔀閳A形、絲狀或梨形。
支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。
支原體污染細胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。
如果懷疑細胞被支原體污染可使用支原體檢測試劑盒進行檢測，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進行處理。
4、霉菌污染
同真菌感染一致，因為培養(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染早期難以發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時往往已經為時過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，如同風中柳絮，一般不仔細看發(fā)覺不出來。細胞仍可生長，但時間一長，細胞的狀態(tài)就變差，不再增長。
處理方法：建議果斷舍棄該污染細胞，將環(huán)境徹底消毒，因為霉菌的頑固可能會導致下幾批細胞都會污染，所以，采用酒精徹底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍，把水盤里加上飽和量的硫酸銅。千萬不可大意!
5、黑膠蟲污染
開始污染時對細胞無影響，當數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產生影響。400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除換血清外無須特殊處理。
處理方法：可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率，盡早處理細胞，越快越好。如果實在來不及了。
注意事項：
1、要保證實驗室和培養(yǎng)箱的潔凈，按時殺菌，可以用酒精擦拭和紫外照射的方法。必要時可以通臭氧過夜。
2、新到的細胞、培養(yǎng)基、血清都可以做一下簡單的污染檢測后再開始實驗。另外要注意每次試劑量配制不宜過多，建議分裝使用，分裝時用針頭濾器過濾一次。
3、進行實驗操作時一定要按照實驗室的要求，確保無菌操作。準備好細胞房專業(yè)連體潔凈衣，戴好口罩和手套。所有進超凈臺的物品最好都用酒精擦拭一遍，超凈臺里面的東西一定要盡量少放，東西太多會影響超凈臺內空氣流通及空氣除菌。
急救方法：
1、 判斷污染源：一旦發(fā)現(xiàn)細胞有污染的跡象或已污染，立即判斷可能的污染源：有無操作不當？培養(yǎng)基、胰酶、PBS等顏色、澄清度是否正常？
2、及時處理：若確定現(xiàn)有的培養(yǎng)基、胰酶、PBS可用，則繼續(xù)使用；若無法確定則新配完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶，原有的液體在確定是否污染后再做處理。
注：若條件允許，細胞污染后zui 好的處理方式是：丟棄�。�！
1 、若為霉菌污染，在以PBS潤洗2~3遍后換液，無需加入高濃度雙抗。培養(yǎng)48h后污染未再次出現(xiàn)即可。
2 、若為真菌污染，在PBS潤洗、換液后可加入兩性霉素B（兩性霉素B有細胞毒性，不推薦使用），也可加入300μg/mL氟康唑培養(yǎng)，污染控制后改用150μg/mL培養(yǎng)2~3代
3、 若懷疑支原體污染，則可進行PCR檢測或直接使用支原體清除試劑。也可購買環(huán)丙沙星注射液，于超凈臺內打開直接添加到培養(yǎng)基中，以20μg/mL濃度2代后改用10μg/mL濃度持續(xù)培養(yǎng)約2周。
很多人把自己培養(yǎng)的細胞稱為寶寶不是沒有道理的，因為細胞確實就是這么的脆弱，但是只要我們做好預防，用心仔細，大多數(shù)細胞污染是完全可以避免的。
細胞污染一般可分為微生物污染和真核生物污染。其中微生物污染包括真菌和酵母、細菌、支原體等。而真核生物一般是細胞系間的交叉污染。 細胞常見的污染情況總結如下：
1、細菌污染：
細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米(μm)計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。
一旦發(fā)生細菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內顏色變黃，表明有大量酸性物質產生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結果。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。
看到這種，別猶豫了你的細胞被污染了，那么怎么辦呢，基本原則立馬扔掉，別擴大污染，如果你的細胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復沖洗幾遍，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉su、新霉su（50ug/ml）等，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。
2、真菌污染：
是細胞培養(yǎng)過程中常見的一種，尤其在梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。
真菌污染真的不建議處理，因為孢子容易飄散，可能這瓶沒9過來，又擴大了污染，建議預防為主，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅，就是藍色的那種東西。哎，如果你非救不可，可以采用兩性霉su B（0.25-2.5），三天后換液加入含PS的培養(yǎng)液。
3、支原體污染：
支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(小直徑0．2um)并生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性�？蔀閳A形、絲狀或梨形。
支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。
支原體污染細胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。
如果懷疑細胞被支原體污染可使用支原體檢測試劑盒進行檢測，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進行處理。
4、霉菌污染
同真菌感染一致，因為培養(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染早期難以發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時往往已經為時過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，如同風中柳絮，一般不仔細看發(fā)覺不出來。細胞仍可生長，但時間一長，細胞的狀態(tài)就變差，不再增長。
處理方法：建議果斷舍棄該污染細胞，將環(huán)境徹底消毒，因為霉菌的頑固可能會導致下幾批細胞都會污染，所以，采用酒精徹底底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍，把水盤里加上飽和量的硫酸銅。千萬不可大意!
5、黑膠蟲污染
開始污染時對細胞無影響，當數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產生影響。400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除換血清外無須特殊處理。
處理方法：可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率，盡早處理細胞，越快越好。如果實在來不及了。
注意事項：
1、要保證實驗室和培養(yǎng)箱的潔凈，按時殺菌，可以用酒精擦拭和紫外照射的方法。必要時可以通臭氧過夜。
2、新到的細胞、培養(yǎng)基、血清都可以做一下簡單的污染檢測后再開始實驗。另外要注意每次試劑量配制不宜過多，建議分裝使用，分裝時用針頭濾器過濾一次。
3、進行實驗操作時一定要按照實驗室的要求，確保無菌操作。準備好細胞房專業(yè)連體潔凈衣，戴好口罩和手套。所有進超凈臺的物品最好都用酒精擦拭一遍，超凈臺里面的東西一定要盡量少放，東西太多會影響超凈臺內空氣流通及空氣除菌。
急救方法：
1、 判斷污染源：一旦發(fā)現(xiàn)細胞有污染的跡象或已污染，立即判斷可能的污染源：有無操作不當？培養(yǎng)基、胰酶、PBS等顏色、澄清度是否正常？
2、及時處理：若確定現(xiàn)有的培養(yǎng)基、胰酶、PBS可用，則繼續(xù)使用；若無法確定則新配完全培養(yǎng)基、PBS、胰酶，原有的液體在確定是否污染后再做處理。
注：若條件允許，細胞污染后zui 好的處理方式是：丟棄�。�！
1 、若為霉菌污染，在以PBS潤洗2~3遍后換液，無需加入高濃度雙抗。培養(yǎng)48h后污染未再次出現(xiàn)即可。
2 、若為真菌污染，在PBS潤洗、換液后可加入兩性霉素B（兩性霉素B有細胞毒性，不推薦使用），也可加入300μg/mL氟康唑培養(yǎng)，污染控制后改用150μg/mL培養(yǎng)2~3代
3、 若懷疑支原體污染，則可進行PCR檢測或直接使用支原體清除試劑。也可購買環(huán)丙沙星注射液，于超凈臺內打開直接添加到培養(yǎng)基中，以20μg/mL濃度2代后改用10μg/mL濃度持續(xù)培養(yǎng)約2周。
很多人把自己培養(yǎng)的細胞稱為寶寶不是沒有道理的，因為細胞確實就是這么的脆弱，但是只要我們做好預防，用心仔細，大多數(shù)細胞污染是完全可以避免的。
