多色流式細(xì)胞術(shù)該進(jìn)行配色的方法與技巧介紹
流式細(xì)胞術(shù)是一種利用流式細(xì)胞儀對快速流動的細(xì)胞或顆粒進(jìn)行多參數(shù)分析的技術(shù)，能夠?qū)?xì)胞表面和內(nèi)部的蛋白質(zhì)、DNA、RNA等進(jìn)行定量檢測和分類，同時可實現(xiàn)細(xì)胞的分選。
流式抗體（FACS Antibody）是專為流式細(xì)胞術(shù)設(shè)計的抗體，用于檢測和分析細(xì)胞表面或內(nèi)部的特定蛋白質(zhì)。這些抗體通常帶有熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀通過檢測其發(fā)出的熒光信號來識別并分析細(xì)胞特征（如圖1）。流式細(xì)胞術(shù)可使用直接標(biāo)記（如FITC、PE、APC等）的抗體進(jìn)行檢測，或通過未標(biāo)記抗體進(jìn)行間接檢測。
流式抗體的特點：
1）熒光標(biāo)記：流式抗體通常結(jié)合熒光染料，如FITC、PE、APC 等，便于在流式細(xì)胞儀中檢測目標(biāo)抗原的表達(dá)水平。
2）高特異性和親和力：抗體需對目標(biāo)抗原高度特異，以確保流式檢測中的精確性。
3）低非特異性結(jié)合：流式抗體通常經(jīng)過優(yōu)化，以減少非特異性結(jié)合，提高信噪比。
4）穩(wěn)定性：流式抗體的熒光標(biāo)記物應(yīng)在實驗條件下具有較高的穩(wěn)定性，以保證信號不受環(huán)境光和樣品處理的影響。
流式抗體的類型：
1）單克隆抗體：針對單一抗原表位，提供一致性高、特異性強(qiáng)的信號，是流式細(xì)胞術(shù)中的首選。
2）多克隆抗體：識別抗原的多個表位，信號強(qiáng)度較高，但特異性較單克隆抗體低，通常在特定應(yīng)用中使用。
3）直接標(biāo)記抗體：抗體直接結(jié)合熒光染料，用于單一染色，便于操作，信噪比較高。
4）間接標(biāo)記抗體：使用未標(biāo)記的抗體加上熒光標(biāo)記的二抗，用于增加信號強(qiáng)度或在稀有抗體不足的情況下應(yīng)用。
5）異型對照抗體：用作陰性對照，以確保信號特異性，排除非特異性結(jié)合的影響。
流式抗體的選擇：
1）抗體的特異性和親和力：根據(jù)目標(biāo)抗原，選擇已驗證具有良好特異性和親和力的抗體，以確保檢測的準(zhǔn)確性。
2）熒光染料的選擇：根據(jù)多重染色實驗的要求選擇不同光譜的熒光染料，避免光譜重疊并優(yōu)化信號檢測。
3）抗體來源：選擇與實驗物種匹配的抗體來源，以減少交叉反應(yīng)。
4）直接或間接標(biāo)記：對于高表達(dá)抗原，直接標(biāo)記抗體更簡便；對于低表達(dá)抗原，間接標(biāo)記抗體可提高信號。
5）適當(dāng)?shù)膶φ眨喊ó愋蛯φ�、未染色對照、單染色對照等，以校正信號背景和�?yōu)化數(shù)據(jù)分析。
6）選擇合適的流式抗體能夠顯著提高實驗的特異性、信噪比和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
多色流式細(xì)胞術(shù)該如何進(jìn)行配色？
流式細(xì)胞實驗表面上是一個非常簡單的試驗，但是對于大多數(shù)新手來說，除了要慎重選擇抗體之外，還要熟悉如何進(jìn)行熒光配色，最大限度地減少對補(bǔ)償和重疊的調(diào)整，這也是流式實驗的重中之重。
大部分科研工作者對流式的應(yīng)用還局限于四色以內(nèi)分析，對于多色（6色以上）分析往往掌握不好，究其原因是染料搭配不合適，導(dǎo)致各染料之間干擾很大，結(jié)果很難分析。本文總結(jié)了流式多色染色熒光搭配的幾點技巧以供參考：
技巧1：選擇合適的目標(biāo) Marker并確定Marker 的表達(dá)位置
通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在試驗之前需要確定好Marker以及Marker 之間的邏輯關(guān)系（圈門的父子關(guān)系，比如 T 細(xì)胞CD3 是「父」，而 CD4 或者 CD8 就是子」）。
對于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核的 Marker，需要對細(xì)胞進(jìn)行固定破膜/破核膜。在做胞質(zhì)或胞核 Marker 染色實驗操作時，需要先染細(xì)胞表面 Marker，再對細(xì)胞進(jìn)行固定破膜，最后對胞內(nèi)或核內(nèi) Marker 染色。
一般來說，絕大部分 CD 分子指標(biāo)，都是細(xì)胞表面指標(biāo)；IL 白介系列、IFN-γ、TNF-α 等，屬于胞內(nèi)指標(biāo)；而最常見的核內(nèi)染色指標(biāo)是 Foxp3（如表）
技巧2：選擇流式細(xì)胞儀能檢測的染料
要充分了解流式細(xì)胞儀有哪些激光器，有哪些濾光片通道，充分利用儀器允許的全部熒光染料，盡量選用多激光激發(fā)。
如圖2列出了流式細(xì)胞儀的激發(fā)器和每個激發(fā)器對應(yīng)能檢測的染料[1]。下圖只是列出了每個激發(fā)器可能激發(fā)的染料，并未列出所有染料，并不是儀器配置了該激發(fā)器就一定能激發(fā)出對應(yīng)的染料，還需要根據(jù)儀器的通道配置來選擇，即每個激發(fā)器對應(yīng)有哪些檢測通道，而每個檢測通道只能對應(yīng)檢測一種染料，但不同染料可能是由同一個檢測通道來檢測，那么這些染料我們稱之為熒光對等染料，熒光對等染料是不能共用的。
技巧3.強(qiáng)弱互補(bǔ)
熒光染料亮度有強(qiáng)弱之分，抗原表達(dá)有高低區(qū)別，因此弱表達(dá)抗原應(yīng)該選擇強(qiáng)熒光染料，強(qiáng)表達(dá)抗原選擇弱熒光染料，使染料的亮度與抗原密度匹配。通常，根據(jù)待測細(xì)胞類型中，相應(yīng)抗原的表達(dá)量，可以粗略地將抗原分子分為三類[2]：
1）很容易鑒定、容易區(qū)分陰陽性細(xì)胞群、陰陽性峰明顯分開的抗原。例如：CD3，CD4，CD19 等。
2）很容易鑒定、較高水平表達(dá)、經(jīng)常連續(xù)性表達(dá)。例如：CD27，CD28，CD45RA, CD45RO 等。
3）低水平表達(dá)、激活性 Marker、未知但關(guān)鍵。例如：CD25，STAT5，F(xiàn)oxp3 等。
同樣，弱表達(dá)抗原放在被干擾較小的檢測通道，而強(qiáng)表達(dá)抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道,比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC這四色一起檢測時，弱表達(dá)抗原應(yīng)該搭配APC熒光染料標(biāo)記的抗體；強(qiáng)表達(dá)的抗原最終染色的信號較強(qiáng)，容易對其他檢測通道造成干擾，因此我們應(yīng)該選擇對其他通道干擾較小的熒光染料。
因抗原表達(dá)密度受細(xì)胞類型以及細(xì)胞活化程度的影響，所以在此無法詳細(xì)列出各抗原的表達(dá)密度強(qiáng)弱。但熒光染料的強(qiáng)弱是固定的，熒光的強(qiáng)度與染色指數(shù)(Stain Index)有關(guān)，一般染色指數(shù)越高，熒光強(qiáng)度越好；染色指數(shù)較低，染色強(qiáng)度相對較差，通過染色指數(shù)可以直接比較出各個熒光染料的強(qiáng)度（如圖3）。
技巧4：表達(dá)互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道，共表達(dá)的抗原避免放在相互干擾的通道
表達(dá)相互排斥的抗原指的是兩種抗原不會同時表達(dá)在一種細(xì)胞上，這兩種抗原表達(dá)在兩種細(xì)胞上（例如CD4和CD8），因此流式圖上分群很明顯，即使熒光染料之間干擾很大，也很容易通過補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)避免干擾；
而共表達(dá)的抗原指的是這兩種抗原表達(dá)在同一種細(xì)胞上（例如CD4和CD25），在流式圖上我們是要分析雙陽性的細(xì)胞比例，因此如果這兩個抗體對應(yīng)的熒光染料之間有干擾，則會對圈門結(jié)果造成干擾，影響分析的細(xì)胞比例。
當(dāng)然，選擇優(yōu)質(zhì)的特異性抗體是實驗成功的根本保證。在設(shè)計多色流式 panel 時，重要的是要了解儀器的配置，以及如何最佳地組合多種熒光染料，以最大程度地減少光譜重疊、提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。
TargetMol 可為您提供多種靶點的流式抗體，可用于流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）、 ELISA、免疫印跡試驗（Western Blot, WB）和免疫熒光(Immunofluorescence, IF)等多種實驗。
TargetMol流式抗體產(chǎn)品
目前，TargetMol 可提供超過 2350+ 種流式抗體產(chǎn)品，覆蓋了多種不同靶點、不同宿主，不同熒光標(biāo)記的特異性檢測一抗。我們的產(chǎn)品以溶液形式提供，操作簡單方便。產(chǎn)品本身有嚴(yán)格的質(zhì)控、高批次間一致性、高純度和高親和力；能夠滿足多種不同檢測靶點對于流式抗體的特異性和靈敏度要求。
TargetMol流式抗體產(chǎn)品優(yōu)勢
哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)：
我們的抗原使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，能最大限度保留人源蛋白天然結(jié)構(gòu)、功能以及翻譯后修飾。
兔源單克隆重組抗體：
我們的抗體使用兔子為免疫載體，兔子具有成熟的免疫機(jī)制并且與人同源性低。兔源抗體具有親和力強(qiáng)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、多樣性豐富等特點。此外，重組抗體的制備批次間差異小。
高穩(wěn)定性：
產(chǎn)品均通過凍融穩(wěn)定性和加速穩(wěn)定性測試，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
高覆蓋度、多表位、多標(biāo)記：
針對370+種人源蛋白兔單抗，每種抗原可提供多個潛在不同表位的抗體，系列抗體可以間接標(biāo)記多種熒光蛋白（APC、PE等）或熒光小分子（AF488、AF555、AF647等）。
產(chǎn)品驗證數(shù)據(jù)：
Flow cytometry on MV4-11 using anti CD47 (red) rabbit mAb and goat anti-rabbit IgG (H+L), BV405,control cells were stained only with BV405 (Blue)
參考資料：
[1]Cossarizza A, et,al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973.
[2]Flores-Montero J,et,al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019 Dec;475:112618.
[3]Mair F,et,al. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.
流式抗體（FACS Antibody）是專為流式細(xì)胞術(shù)設(shè)計的抗體，用于檢測和分析細(xì)胞表面或內(nèi)部的特定蛋白質(zhì)。這些抗體通常帶有熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀通過檢測其發(fā)出的熒光信號來識別并分析細(xì)胞特征（如圖1）。流式細(xì)胞術(shù)可使用直接標(biāo)記（如FITC、PE、APC等）的抗體進(jìn)行檢測，或通過未標(biāo)記抗體進(jìn)行間接檢測。
▲圖1：流式抗體的工作原理示意圖
流式抗體的特點：
1）熒光標(biāo)記：流式抗體通常結(jié)合熒光染料，如FITC、PE、APC 等，便于在流式細(xì)胞儀中檢測目標(biāo)抗原的表達(dá)水平。
2）高特異性和親和力：抗體需對目標(biāo)抗原高度特異，以確保流式檢測中的精確性。
3）低非特異性結(jié)合：流式抗體通常經(jīng)過優(yōu)化，以減少非特異性結(jié)合，提高信噪比。
4）穩(wěn)定性：流式抗體的熒光標(biāo)記物應(yīng)在實驗條件下具有較高的穩(wěn)定性，以保證信號不受環(huán)境光和樣品處理的影響。
流式抗體的類型：
1）單克隆抗體：針對單一抗原表位，提供一致性高、特異性強(qiáng)的信號，是流式細(xì)胞術(shù)中的首選。
2）多克隆抗體：識別抗原的多個表位，信號強(qiáng)度較高，但特異性較單克隆抗體低，通常在特定應(yīng)用中使用。
3）直接標(biāo)記抗體：抗體直接結(jié)合熒光染料，用于單一染色，便于操作，信噪比較高。
4）間接標(biāo)記抗體：使用未標(biāo)記的抗體加上熒光標(biāo)記的二抗，用于增加信號強(qiáng)度或在稀有抗體不足的情況下應(yīng)用。
5）異型對照抗體：用作陰性對照，以確保信號特異性，排除非特異性結(jié)合的影響。
流式抗體的選擇：
1）抗體的特異性和親和力：根據(jù)目標(biāo)抗原，選擇已驗證具有良好特異性和親和力的抗體，以確保檢測的準(zhǔn)確性。
2）熒光染料的選擇：根據(jù)多重染色實驗的要求選擇不同光譜的熒光染料，避免光譜重疊并優(yōu)化信號檢測。
3）抗體來源：選擇與實驗物種匹配的抗體來源，以減少交叉反應(yīng)。
4）直接或間接標(biāo)記：對于高表達(dá)抗原，直接標(biāo)記抗體更簡便；對于低表達(dá)抗原，間接標(biāo)記抗體可提高信號。
5）適當(dāng)?shù)膶φ眨喊ó愋蛯φ�、未染色對照、單染色對照等，以校正信號背景和�?yōu)化數(shù)據(jù)分析。
6）選擇合適的流式抗體能夠顯著提高實驗的特異性、信噪比和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
多色流式細(xì)胞術(shù)該如何進(jìn)行配色？
流式細(xì)胞實驗表面上是一個非常簡單的試驗，但是對于大多數(shù)新手來說，除了要慎重選擇抗體之外，還要熟悉如何進(jìn)行熒光配色，最大限度地減少對補(bǔ)償和重疊的調(diào)整，這也是流式實驗的重中之重。
大部分科研工作者對流式的應(yīng)用還局限于四色以內(nèi)分析，對于多色（6色以上）分析往往掌握不好，究其原因是染料搭配不合適，導(dǎo)致各染料之間干擾很大，結(jié)果很難分析。本文總結(jié)了流式多色染色熒光搭配的幾點技巧以供參考：
技巧1：選擇合適的目標(biāo) Marker并確定Marker 的表達(dá)位置
通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在試驗之前需要確定好Marker以及Marker 之間的邏輯關(guān)系（圈門的父子關(guān)系，比如 T 細(xì)胞CD3 是「父」，而 CD4 或者 CD8 就是子」）。
對于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核的 Marker，需要對細(xì)胞進(jìn)行固定破膜/破核膜。在做胞質(zhì)或胞核 Marker 染色實驗操作時，需要先染細(xì)胞表面 Marker，再對細(xì)胞進(jìn)行固定破膜，最后對胞內(nèi)或核內(nèi) Marker 染色。
一般來說，絕大部分 CD 分子指標(biāo)，都是細(xì)胞表面指標(biāo)；IL 白介系列、IFN-γ、TNF-α 等，屬于胞內(nèi)指標(biāo)；而最常見的核內(nèi)染色指標(biāo)是 Foxp3（如表）
技巧2：選擇流式細(xì)胞儀能檢測的染料
要充分了解流式細(xì)胞儀有哪些激光器，有哪些濾光片通道，充分利用儀器允許的全部熒光染料，盡量選用多激光激發(fā)。
如圖2列出了流式細(xì)胞儀的激發(fā)器和每個激發(fā)器對應(yīng)能檢測的染料[1]。下圖只是列出了每個激發(fā)器可能激發(fā)的染料，并未列出所有染料，并不是儀器配置了該激發(fā)器就一定能激發(fā)出對應(yīng)的染料，還需要根據(jù)儀器的通道配置來選擇，即每個激發(fā)器對應(yīng)有哪些檢測通道，而每個檢測通道只能對應(yīng)檢測一種染料，但不同染料可能是由同一個檢測通道來檢測，那么這些染料我們稱之為熒光對等染料，熒光對等染料是不能共用的。
▲圖2：不同激發(fā)器可激發(fā)的熒光染料
技巧3.強(qiáng)弱互補(bǔ)
熒光染料亮度有強(qiáng)弱之分，抗原表達(dá)有高低區(qū)別，因此弱表達(dá)抗原應(yīng)該選擇強(qiáng)熒光染料，強(qiáng)表達(dá)抗原選擇弱熒光染料，使染料的亮度與抗原密度匹配。通常，根據(jù)待測細(xì)胞類型中，相應(yīng)抗原的表達(dá)量，可以粗略地將抗原分子分為三類[2]：
1）很容易鑒定、容易區(qū)分陰陽性細(xì)胞群、陰陽性峰明顯分開的抗原。例如：CD3，CD4，CD19 等。
2）很容易鑒定、較高水平表達(dá)、經(jīng)常連續(xù)性表達(dá)。例如：CD27，CD28，CD45RA, CD45RO 等。
3）低水平表達(dá)、激活性 Marker、未知但關(guān)鍵。例如：CD25，STAT5，F(xiàn)oxp3 等。
同樣，弱表達(dá)抗原放在被干擾較小的檢測通道，而強(qiáng)表達(dá)抗原放在對其他通道干擾較小的檢測通道,比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC這四色一起檢測時，弱表達(dá)抗原應(yīng)該搭配APC熒光染料標(biāo)記的抗體；強(qiáng)表達(dá)的抗原最終染色的信號較強(qiáng)，容易對其他檢測通道造成干擾，因此我們應(yīng)該選擇對其他通道干擾較小的熒光染料。
因抗原表達(dá)密度受細(xì)胞類型以及細(xì)胞活化程度的影響，所以在此無法詳細(xì)列出各抗原的表達(dá)密度強(qiáng)弱。但熒光染料的強(qiáng)弱是固定的，熒光的強(qiáng)度與染色指數(shù)(Stain Index)有關(guān)，一般染色指數(shù)越高，熒光強(qiáng)度越好；染色指數(shù)較低，染色強(qiáng)度相對較差，通過染色指數(shù)可以直接比較出各個熒光染料的強(qiáng)度（如圖3）。
▲圖3：不同類型熒光染料的染色指數(shù)排行[3]
技巧4：表達(dá)互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道，共表達(dá)的抗原避免放在相互干擾的通道
表達(dá)相互排斥的抗原指的是兩種抗原不會同時表達(dá)在一種細(xì)胞上，這兩種抗原表達(dá)在兩種細(xì)胞上（例如CD4和CD8），因此流式圖上分群很明顯，即使熒光染料之間干擾很大，也很容易通過補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)避免干擾；
而共表達(dá)的抗原指的是這兩種抗原表達(dá)在同一種細(xì)胞上（例如CD4和CD25），在流式圖上我們是要分析雙陽性的細(xì)胞比例，因此如果這兩個抗體對應(yīng)的熒光染料之間有干擾，則會對圈門結(jié)果造成干擾，影響分析的細(xì)胞比例。
當(dāng)然，選擇優(yōu)質(zhì)的特異性抗體是實驗成功的根本保證。在設(shè)計多色流式 panel 時，重要的是要了解儀器的配置，以及如何最佳地組合多種熒光染料，以最大程度地減少光譜重疊、提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。
TargetMol 可為您提供多種靶點的流式抗體，可用于流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）、 ELISA、免疫印跡試驗（Western Blot, WB）和免疫熒光(Immunofluorescence, IF)等多種實驗。
TargetMol流式抗體產(chǎn)品
目前，TargetMol 可提供超過 2350+ 種流式抗體產(chǎn)品，覆蓋了多種不同靶點、不同宿主，不同熒光標(biāo)記的特異性檢測一抗。我們的產(chǎn)品以溶液形式提供，操作簡單方便。產(chǎn)品本身有嚴(yán)格的質(zhì)控、高批次間一致性、高純度和高親和力；能夠滿足多種不同檢測靶點對于流式抗體的特異性和靈敏度要求。
TargetMol流式抗體產(chǎn)品優(yōu)勢
哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)：
我們的抗原使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，能最大限度保留人源蛋白天然結(jié)構(gòu)、功能以及翻譯后修飾。
兔源單克隆重組抗體：
我們的抗體使用兔子為免疫載體，兔子具有成熟的免疫機(jī)制并且與人同源性低。兔源抗體具有親和力強(qiáng)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、多樣性豐富等特點。此外，重組抗體的制備批次間差異小。
高穩(wěn)定性：
產(chǎn)品均通過凍融穩(wěn)定性和加速穩(wěn)定性測試，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
高覆蓋度、多表位、多標(biāo)記：
針對370+種人源蛋白兔單抗，每種抗原可提供多個潛在不同表位的抗體，系列抗體可以間接標(biāo)記多種熒光蛋白（APC、PE等）或熒光小分子（AF488、AF555、AF647等）。
產(chǎn)品驗證數(shù)據(jù)：
參考資料：
[1]Cossarizza A, et,al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973.
[2]Flores-Montero J,et,al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019 Dec;475:112618.
[3]Mair F,et,al. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.
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