第一期的Q&A相信大家對重組蛋白這個小可愛已經(jīng)有了初步了解，接下來就讓我們就其表達(dá)體系，使用中的常見問題繼續(xù)一探究竟吧！！

一、表達(dá)體系與選擇

（一）重組蛋白表達(dá)體系

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：優(yōu)點是經(jīng)濟(jì)實惠、表達(dá)背景清晰、表達(dá)快速便捷、產(chǎn)量高、應(yīng)用范圍廣泛。然而，缺點也較為明顯，容易形成包涵體，且翻譯后無法修飾表達(dá)，對于大分子蛋白來說，表達(dá)相對困難。例如，一些復(fù)雜的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中可能無法正確折疊，導(dǎo)致活性降低。

酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：具有經(jīng)濟(jì)實惠、成本投入低、蛋白表達(dá)迅速且產(chǎn)量高的優(yōu)點，部分蛋白還可以實現(xiàn)翻譯后修飾。但缺點是蛋白包含非人源糖基化以及高甘露糖修飾，可能會影響蛋白的功能和活性。

昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：蛋白表達(dá)基因容量大，可溶蛋白相對更高，對于用于制備毒性蛋白，可實現(xiàn)翻譯后修飾。不過，蛋白表達(dá)周期長，需要投入的成本高，而且表達(dá)的蛋白缺少部分糖基化。例如，在制備某些復(fù)雜的毒性蛋白時，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，但整個過程可能需要數(shù)周甚至數(shù)月的時間。

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：蛋白可溶性高，且生產(chǎn)的蛋白內(nèi)毒素較低，蛋白活性更高而且可實現(xiàn)翻譯后修飾。但缺點是蛋白表達(dá)周期長而且投入的成本相對較高。一般來說，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的成本可能是其他表達(dá)系統(tǒng)的數(shù)倍甚至更高。

（二）選擇重組蛋白技巧

表達(dá)體系：根據(jù)實驗?zāi)康暮偷鞍滋匦赃x擇合適的表達(dá)體系。如果需要快速獲得大量蛋白且對翻譯后修飾要求不高，可以選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)；如果需要一定程度的翻譯后修飾且對糖基化要求不那么嚴(yán)格，可以考慮酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；對于復(fù)雜的蛋白尤其是需要毒性蛋白表達(dá)或具有特定翻譯后修飾要求的，可以選擇昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

標(biāo)簽及位置：蛋白標(biāo)簽有助于目的蛋白的表達(dá)、純化、檢測和示蹤等。常用的標(biāo)簽有 His/6xHis、Flag、GST、C-Myc、HA、GFP、mCherry、C-Fc 等。標(biāo)簽位置會對重組蛋白的結(jié)構(gòu)與特性造成影響，對于較難表達(dá)或較容易降解的蛋白，可將融合標(biāo)簽選擇在N端以提高穩(wěn)定性和減小免疫原性；若為分泌蛋白，建議構(gòu)建在C端，因為在分泌到高爾基體的過程中，N 端的融合標(biāo)簽會隨著 N 端信號肽的切除而失去作用。

有無載體蛋白：載體蛋白可提高重組蛋白的穩(wěn)定性，避免重組蛋白粘附在管壁導(dǎo)致活性下降。常用的載體蛋白有 0.1% BSA、5%人血清白蛋白 HSA、10% FBS、海藻糖等，最常用的是 0.1% BSA。

是否無動物成分：無動物成分重組蛋白在生產(chǎn)過程中不使用任何動物來源的原料和試劑，避免了痕量的動物成分、動物病原體和抗原對實驗造成影響。主要應(yīng)用于可能進(jìn)入臨床試驗的重組蛋白藥物研究和需要明確培養(yǎng)條件的實驗。

內(nèi)毒素水平：內(nèi)毒素主要是G -菌細(xì)胞壁外表層結(jié)構(gòu)成分，本質(zhì)是脂多糖LPS。內(nèi)毒素污染十分危險，可引發(fā)動物內(nèi)毒素休克、炎癥或敗血癥，并對組織培養(yǎng)物有害。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白具有更高水平的內(nèi)毒素，在選擇重組蛋白產(chǎn)品時，尤其是應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、動物體內(nèi)實驗等領(lǐng)域時，內(nèi)毒素水平是重要參考要素。

活性：重組蛋白活性分為ED50和比活力兩個數(shù)據(jù)。ED50是能引起50%陽性反應(yīng)或50% 最大效應(yīng)的濃度或劑量，一般來說 ED50 值越小，作用越強(qiáng)。比活力是在特定條件下，單位重量蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，比活力越大，酶的純度越高。

純度：重組蛋白的純度可通過SDS-PAGE或HPLC鑒定。高純度的重組蛋白可以減少雜質(zhì)對實驗結(jié)果的干擾。

片段形式：由于技術(shù)限制、表達(dá)效率等問題，重組蛋白使用片段形式可能更易于純化和表達(dá)，提高溶解性和穩(wěn)定性。

二、溶解注意事項

（一）開蓋前離心處理

細(xì)胞因子重組蛋白通常以凍干粉的形式保存，在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上。因此，在開蓋前進(jìn)行離心處理至關(guān)重要。通過離心處理，可以確保蛋白粉末集中在管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解，從而避免因蛋白分散而影響溶解效果。

（二）正確選擇溶解液

不同的重組蛋白需要用特定的溶液溶解，這是由蛋白質(zhì)的性質(zhì)決定的。我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。例如，重組人IL-5需用水溶解，而重組人IL-2則需用 100mM Acetic Acid（醋酸）溶解，重組人TGF-beta1 需用 10mM Citric Acid（檸檬酸），pH3.0 溶解。對于重組細(xì)胞因子凍干粉來說，即使是同一個分子的蛋白，不同批次間的溶解方法也可能會有所不同，因此具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的說明書為準(zhǔn)。

（三）溶解濃度要求

重組蛋白應(yīng)溶解到指定濃度范圍，這對于保持蛋白的穩(wěn)定性至關(guān)重要。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍。如重組人 FGF-6為0.5 - 1.0mg/ml，而重組人Activin B則一定要是0.5mg/ml。如果高于或低于這個濃度范圍，就可能會使細(xì)胞因子的活性下降。如果高于這個濃度范圍，就有可能會超過該因子的最大溶解度，使其無法完全溶解。還有就是高于或低于這個范圍，可能會出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象，同樣會使部分蛋白質(zhì)不溶解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性下降。

（四）避免振蕩溶解

不能用渦旋儀振蕩溶解重組蛋白，因為對于細(xì)胞因子重組蛋白來說，只有具有一定的空間結(jié)構(gòu)才可能使其活性。在凍干粉溶解過程中，用渦旋振蕩器進(jìn)行 vortex 會破壞蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白的活性。

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