一氧化氮（NO）是人體內(nèi)重要的信號(hào)分子，在各種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。它參與調(diào)節(jié)血流，維持細(xì)胞活力，保護(hù)心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞免受缺血性和出血性損傷。NO信號(hào)傳導(dǎo)的異常與心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和各種癌癥密切相關(guān)。重要的是，它的生理和病理影響與其濃度有關(guān)，因此精準(zhǔn)定量生物組織中的NO對(duì)闡明其復(fù)雜作用至關(guān)重要。

然而，準(zhǔn)確測(cè)定生物體內(nèi)的NO水平仍是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的定量試劑盒無(wú)法可靠地測(cè)定體內(nèi)NO。非侵入性成像技術(shù)（如熒光、光聲和余輝成像）有助于檢測(cè)NO，但組織穿透力不足，限制了其在全身成像中的應(yīng)用。磁共振成像（MRI）具有高的空間分辨率和深層組織穿透力，且無(wú)電離輻射，因此適用于疾病診斷和監(jiān)測(cè)。

近日，湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院宋國(guó)勝教授和張曉兵教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種基于超順磁性納米顆粒的NO磁共振成像探針，能夠?qū)崿F(xiàn)高度靈敏且選擇性的NO檢測(cè)。這種探針可檢測(cè)濃度低至0.147 μM的NO，有助于人們更好地了解NO在生理和病理過(guò)程中的多方面作用。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Nature Materials》期刊上。
 

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員將超順磁性氧化鐵納米顆粒與可剪切接頭偶聯(lián)，構(gòu)建了NRBP探針。他們利用Bruker 7T Biospec MRI掃描儀獲得了MRI圖像。他們?cè)?T1荷瘤小鼠上評(píng)估了NRMP探針用于體內(nèi)NO成像的效果，并通過(guò)流式分析等評(píng)估了腫瘤免疫微環(huán)境。在利用NRBP探針檢測(cè)肝損傷時(shí)，他們除了使用BALB/c小鼠，還使用了敲除誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的NOS2^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供）。

技術(shù)路線

構(gòu)建NO響應(yīng)性磁探針（NRMP）并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)表征
↓
利用4T1荷瘤小鼠模型評(píng)估NRMP探針用于體內(nèi)NO成像的效果
↓
利用NRMP探針全面評(píng)估NO在腫瘤生物學(xué)中的作用
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利用NRMP探針篩選免疫療法和評(píng)估肝損傷

研究結(jié)果
1. 構(gòu)建NO磁共振成像探針
研究人員將氧化鐵納米顆粒與對(duì)NO敏感的可剪切接頭偶聯(lián)，形成超順磁性納米顆粒。為了增強(qiáng)其親水性，他們將這些納米顆粒進(jìn)一步與PEG-NH₂偶聯(lián)，最終形成NO響應(yīng)性磁探針（NRMP，圖1）。與NO的相互作用會(huì)導(dǎo)致探針膨脹，增加氧化鐵的顆粒間距離，這會(huì)延長(zhǎng)橫向弛豫時(shí)間（T₂），導(dǎo)致T₂ MRI信號(hào)強(qiáng)度增加（圖1）。
 

圖1. NRMP探針的構(gòu)建

他們接下來(lái)測(cè)定了加入不同濃度NO后縱向和橫向弛豫時(shí)間的變化，以評(píng)估NRMP探針的響應(yīng)行為。隨著NO濃度增加，NRMP探針的橫向弛豫率（r₂）從64.3 mM-1 s-1顯著降至27.9 mM-1 s-1。對(duì)NRMP探針的選擇性進(jìn)行測(cè)試時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)只有在NO存在的情況下，T₂弛豫時(shí)間才會(huì)明顯增加，這證明了NRMP探針的高度特異性和抗干擾性。

研究人員還利用T₂ MRI對(duì)檢測(cè)NO的靈敏度進(jìn)行了定量。他們發(fā)現(xiàn)，即使NO的濃度增加極少（~1 μM），T₂ MRI圖像也會(huì)更亮，表明靈敏度很高。而且，信號(hào)定量結(jié)果與NO濃度表現(xiàn)出強(qiáng)的線性相關(guān)，最低可檢測(cè)濃度低至0.147 μM的NO。

2. NRMP探針用于體內(nèi)NO成像的效果
作為一種T₂加權(quán)MRI探針，NRMP與NO發(fā)生作用之前，最初會(huì)顯示出陰性對(duì)比度。靜脈注射后，NRMP探針在腫瘤內(nèi)積累，增強(qiáng)陰性對(duì)比度，減弱T₂ MRI信號(hào)。與腫瘤內(nèi)NO的相互作用導(dǎo)致NRMP探針膨脹，減弱陰性對(duì)比度，增加MRI信號(hào)強(qiáng)度，并產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)比度（圖2）。

隨后，研究人員利用4T1荷瘤小鼠模型進(jìn)行了體內(nèi)成像。他們利用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中NO的增加，并在注射NRMP或?qū)φ仗结樅筮M(jìn)行MRI。在LPS + NRMP組，他們?cè)?小時(shí)內(nèi)觀察到最初變暗，然后是亮度增加，表明NO誘導(dǎo)了從陰性到陽(yáng)性對(duì)比度的轉(zhuǎn)換（圖2）。對(duì)MRI信號(hào)強(qiáng)度的定量顯示，與對(duì)照組相比，LPS處理組的腫瘤信號(hào)在24小時(shí)后明顯增加。之后，他們建立了MRI信號(hào)強(qiáng)度和NO濃度之間的相關(guān)曲線。

圖2. NRMP用于體內(nèi)NO成像的效果

利用NRMP探針評(píng)估NO在腫瘤生物學(xué)中的作用
目前，NO在體內(nèi)促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)的特定濃度仍不清楚。于是，研究人員探究了NO對(duì)腫瘤免疫和生長(zhǎng)的劑量依賴作用。他們以低劑量、高劑量的NO供體或PBS處理4T1荷瘤小鼠，并利用NRMP探針對(duì)腫瘤內(nèi)的NO濃度進(jìn)行定量。在計(jì)算注射NRMP前后的T₂ MRI信號(hào)強(qiáng)度比后，結(jié)果顯示NO供體劑量越高，信號(hào)強(qiáng)度比越大。

接下來(lái)，研究人員探索了NO誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡的能力。他們測(cè)定了4T1荷瘤小鼠在處理后的損傷相關(guān)分子模式釋放情況，如鈣網(wǎng)蛋白（CRT）和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）。分析結(jié)果顯示，高劑量NO有助于CRT暴露，并能顯著提高HMGB1水平，而低劑量NO的影響很小，這表明高劑量NO通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和HMGB1升高來(lái)促進(jìn)免疫原性細(xì)胞死亡。

后續(xù)分析顯示，高劑量NO處理后，小鼠腫瘤內(nèi)的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞增加，CD8+ T細(xì)胞明顯增加，且M1樣巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1表型極化，而低劑量NO則沒(méi)有這些效果。此外，TNF-α和IL-6在高劑量NO的作用下顯著升高。這些結(jié)果顯示，高劑量NO可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和促進(jìn)免疫原性細(xì)胞死亡來(lái)有效增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

在全面評(píng)估NO對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)與PBS處理組相比，高劑量NO供體明顯抑制了腫瘤生長(zhǎng)，而低劑量NO供體則略微加速了腫瘤生長(zhǎng)。染色結(jié)果顯示，高劑量NO處理后的腫瘤出現(xiàn)了廣泛凋亡和壞死，而低劑量NO處理則增強(qiáng)了CD31的表達(dá)，表明刺激了腫瘤微環(huán)境中的血管生成，這與其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用是一致的。

利用NRMP探針篩選免疫療法
研究人員借助MRI的優(yōu)勢(shì)，對(duì)M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO進(jìn)行成像，從而對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療效果進(jìn)行定量。他們選擇了三種已知能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化的藥物——IFNγ、CpG和R848。通過(guò)計(jì)算T₂ MRI信號(hào)強(qiáng)度比，他們發(fā)現(xiàn)在24小時(shí)后藥物治療小鼠的信號(hào)強(qiáng)度比高于對(duì)照組，其中R848組的升高最為顯著。

同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)藥物治療小鼠的M1樣巨噬細(xì)胞增加，且與M1巨噬細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）顯著增加。其中，R848組表現(xiàn)出最高水平的M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。與對(duì)照組相比，所有治療組的腫瘤體積都明顯縮小，其中R848組療效最高，這與MRI測(cè)定的NO生成一致。這些結(jié)果凸顯了NRMP探針對(duì)NO成像的潛力，可在腫瘤發(fā)生明顯變化之前觀察到M1巨噬細(xì)胞的極化并篩選免疫療法。

利用NRMP探針評(píng)估肝損傷
肝臟中NO水平的實(shí)時(shí)成像對(duì)于了解相關(guān)病理過(guò)程至關(guān)重要。為了評(píng)估NRMP在這方面的能力，研究人員利用PBS或LPS處理小鼠，并注射了NRMP探針。在此實(shí)驗(yàn)中，他們使用了兩種小鼠：BALB/c小鼠和NOS2^-/-小鼠（后者由賽業(yè)生物提供）。

他們觀察到，LPS處理組的肝臟圖像最初變暗，但在30分鐘后變亮，表明NO誘導(dǎo)下MRI對(duì)比度從陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛?yáng)性。相比之下，NOS2^-/-小鼠的肝臟圖像始終保持黑暗，證明沒(méi)有NO生成（圖3）。在左肝葉局部注射LPS和全身注射NRMP后，T₂ MRI信號(hào)強(qiáng)度比證實(shí)左肝葉NO水平更高。結(jié)合解剖和分子成像，NRMP探針能夠有效確定局部肝臟病理。

圖3. 肝臟病理生理分析中的NO成像

結(jié)論
這項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)出一種體內(nèi)檢測(cè)NO的NRMP探針，具有高靈敏度和特異性。它能夠很好地監(jiān)測(cè)NO的變化，防止信號(hào)飽和，并提供精確的結(jié)果。NRMP探針對(duì)于分析NO在腫瘤中的復(fù)雜生理和病理作用很有價(jià)值，有助于靶向治療策略的開(kāi)發(fā)。它還能夠繪制體內(nèi)NO的動(dòng)態(tài)圖譜，這對(duì)肝損傷等疾病至關(guān)重要。

原文檢索
Lu, C., Liao, S., Chen, B. et al. Responsive probes for in vivo magnetic resonance imaging of nitric oxide. Nat. Mater. 24, 133–142 (2025). https://doi.org/10.1038/s41563-024-02054-0