中喬新舟從原代培養(yǎng)到建立永生細胞系的方法總結
原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。原代細胞是可以真實地反映特定細胞在體內的生理狀態(tài)。但是它們一般傳了很少的代數(shù)就會停止增殖并死亡。對于一些需要大量細胞進行的實驗比如生化分解，遺傳篩選等，無法使用原代細胞。因此在體外建立永生細胞以研究細胞生長、分化和衰老是很重要的。本文簡單介紹中喬新舟從原代培養(yǎng)到建立永生細胞系的方法。
三個方案可供選擇：
實驗流程如下：
方案一：SV40 LargeT 介導的永生化細胞
許多病毒基因是可以影響細胞周期的，目前常用的方法是使用SV40 T抗原來誘導永生化。SV40 T抗原已被大量細胞驗證是細胞永生化最簡單有效的試劑，其機制相對容易理解。SV40（simian virus 40）是猿猴腎細胞病毒，SV40編碼兩種腫瘤抗原 (tumor antigen，T抗原)，分別為大T抗原和小T抗原。T抗原的作用是：①大T抗原為細胞轉化的啟動所必需;②轉化細胞表型的維持必需要有大T抗原的連續(xù)表達;③小T抗原對于細胞的轉化不是必需的，但可起加強作用。因此，SV40 Large T 能使細胞進入永生化的增殖狀態(tài)，缺點是存在潛在的致癌風險，可能引起細胞惡性轉化。(如中喬新舟：貨號：ZQ1099 名稱是huvec-Immortalized人臍靜脈內皮細胞-永生化的細胞等)。下圖是CV40基因組DNA的構成元件和永生化的進程：
Figure 1. (a) Structure of SV40 genomic DNA is composed of three elements: the early and late coding units and the regulatory region. (b) Several domains and motifs make up the SV40 T antigens. (c) A brief overview of the process of SV40 induced immortalized transformation. (Ahuja D,2005)
方案二：hTERT介導的永生化細胞
端粒中含有一種逆轉錄酶（TERT），它能催化作為模板的端粒酶反轉錄為端粒DNA，繼而合成到染色體末端，不斷彌補端粒的長度，使細胞持續(xù)生長。然而，正常細胞中通常不表達TERT。為了實現(xiàn)細胞永生化，需要使用轉基因技術構建表達載體，將TERT轉染到細胞中。
Figure 2．端粒酶延長的激活（圖片來自網絡）
hTERT是人端粒酶蛋白部分的催化亞基編碼基因，與端粒酶活性呈現(xiàn)正相關。為了使原代細胞獲得永生化同時維持正常細胞的生理特性，我們將原代細胞轉染人端粒酶逆轉錄酶cDNA（hTERT），從而激活端粒酶活性，維持端粒長度，阻止染色體端粒降解，誘導細胞永生化。在高傳代數(shù)和使用致癌基因時，hTERT永生化細胞忠實地代表了體內正常細胞的生理特性。
方案三：復合型病毒感染介導的永生化細胞
在某些細胞類型中，僅使用一種永生化方法可能無法產生永生細胞，或者有些細胞不適合端粒酶介導的方法，因此，根據(jù)不同的細胞系，最好結合抑制細胞周期和hTERT的表達來永生更多的細胞。這就需要用到復合型病毒感染，通過慢病毒轉染的方式攜帶SV40T及hTERT基因，這種方法綜合了上述兩種方法的優(yōu)缺點，可能既保持了原始特性，也避免核型發(fā)生變異。如：ZQY008人胰腺星狀細胞-永生化；ZQY009 人肝內膽管上皮細胞-永生化等細胞。
此外獲得永生化細胞的方法還有基因編輯技術，化學誘導，物理（穿刺）細胞等技術，中喬新舟原代細胞永生化均通過慢病毒轉染的方式單獨或者混合攜帶SV40T及hTERT基因來獲得。中喬新舟提供上百種人源及動物源的永生化細胞株，以及上百種永生化細胞培養(yǎng)基供科研工作者選擇使用。
永生化細胞應用領域
1. 藥物篩選和開發(fā)：永生化細胞是藥物篩選和毒性測試的理想模型。通過使用這些細胞，可以在實驗室中快速、大規(guī)模地進行藥物篩選，評估藥物的有效性和安全性。
2. 基因研究和功能驗證：由于這些細胞能夠長期增殖，它們成為了研究基因功能和細胞信號通路的重要工具，特別是在基因表達調控、細胞周期、癌癥等領域。
3. 癌癥研究：許多永生化細胞系源于癌細胞，癌細胞的永生化特性使其成為研究癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療的關鍵模型，幫助科學家理解癌癥的生物學機制。
4. 抗體生產：永生化細胞，如CHO細胞，被廣泛用于單克隆抗體和重組蛋白的生產，這對于生物藥物的發(fā)展具有重要意義。
三個方案可供選擇：
實驗流程如下：
方案一：SV40 LargeT 介導的永生化細胞
許多病毒基因是可以影響細胞周期的，目前常用的方法是使用SV40 T抗原來誘導永生化。SV40 T抗原已被大量細胞驗證是細胞永生化最簡單有效的試劑，其機制相對容易理解。SV40（simian virus 40）是猿猴腎細胞病毒，SV40編碼兩種腫瘤抗原 (tumor antigen，T抗原)，分別為大T抗原和小T抗原。T抗原的作用是：①大T抗原為細胞轉化的啟動所必需;②轉化細胞表型的維持必需要有大T抗原的連續(xù)表達;③小T抗原對于細胞的轉化不是必需的，但可起加強作用。因此，SV40 Large T 能使細胞進入永生化的增殖狀態(tài)，缺點是存在潛在的致癌風險，可能引起細胞惡性轉化。(如中喬新舟：貨號：ZQ1099 名稱是huvec-Immortalized人臍靜脈內皮細胞-永生化的細胞等)。下圖是CV40基因組DNA的構成元件和永生化的進程：
Figure 1. (a) Structure of SV40 genomic DNA is composed of three elements: the early and late coding units and the regulatory region. (b) Several domains and motifs make up the SV40 T antigens. (c) A brief overview of the process of SV40 induced immortalized transformation. (Ahuja D,2005)
方案二：hTERT介導的永生化細胞
端粒中含有一種逆轉錄酶（TERT），它能催化作為模板的端粒酶反轉錄為端粒DNA，繼而合成到染色體末端，不斷彌補端粒的長度，使細胞持續(xù)生長。然而，正常細胞中通常不表達TERT。為了實現(xiàn)細胞永生化，需要使用轉基因技術構建表達載體，將TERT轉染到細胞中。
Figure 2．端粒酶延長的激活（圖片來自網絡）
hTERT是人端粒酶蛋白部分的催化亞基編碼基因，與端粒酶活性呈現(xiàn)正相關。為了使原代細胞獲得永生化同時維持正常細胞的生理特性，我們將原代細胞轉染人端粒酶逆轉錄酶cDNA（hTERT），從而激活端粒酶活性，維持端粒長度，阻止染色體端粒降解，誘導細胞永生化。在高傳代數(shù)和使用致癌基因時，hTERT永生化細胞忠實地代表了體內正常細胞的生理特性。
方案三：復合型病毒感染介導的永生化細胞
在某些細胞類型中，僅使用一種永生化方法可能無法產生永生細胞，或者有些細胞不適合端粒酶介導的方法，因此，根據(jù)不同的細胞系，最好結合抑制細胞周期和hTERT的表達來永生更多的細胞。這就需要用到復合型病毒感染，通過慢病毒轉染的方式攜帶SV40T及hTERT基因，這種方法綜合了上述兩種方法的優(yōu)缺點，可能既保持了原始特性，也避免核型發(fā)生變異。如：ZQY008人胰腺星狀細胞-永生化；ZQY009 人肝內膽管上皮細胞-永生化等細胞。
此外獲得永生化細胞的方法還有基因編輯技術，化學誘導，物理（穿刺）細胞等技術，中喬新舟原代細胞永生化均通過慢病毒轉染的方式單獨或者混合攜帶SV40T及hTERT基因來獲得。中喬新舟提供上百種人源及動物源的永生化細胞株，以及上百種永生化細胞培養(yǎng)基供科研工作者選擇使用。
永生化細胞應用領域
1. 藥物篩選和開發(fā)：永生化細胞是藥物篩選和毒性測試的理想模型。通過使用這些細胞，可以在實驗室中快速、大規(guī)模地進行藥物篩選，評估藥物的有效性和安全性。
2. 基因研究和功能驗證：由于這些細胞能夠長期增殖，它們成為了研究基因功能和細胞信號通路的重要工具，特別是在基因表達調控、細胞周期、癌癥等領域。
3. 癌癥研究：許多永生化細胞系源于癌細胞，癌細胞的永生化特性使其成為研究癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療的關鍵模型，幫助科學家理解癌癥的生物學機制。
4. 抗體生產：永生化細胞，如CHO細胞，被廣泛用于單克隆抗體和重組蛋白的生產，這對于生物藥物的發(fā)展具有重要意義。
