細(xì)胞分裂周期蛋白6（CDC6）在DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。作為前復(fù)制復(fù)合物（pre-RC）中的核心成員，如果CDC6發(fā)生突變或缺失，pre-RC將無(wú)法組裝，DNA復(fù)制也會(huì)受到抑制。由于CDC6在細(xì)胞周期進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，其畸變會(huì)導(dǎo)致各種生理和病理變化。在肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等多種癌癥中都觀察到CDC6的異常上調(diào)，并與預(yù)后不良有關(guān)。

因此，CDC6在細(xì)胞周期中的表達(dá)須受到嚴(yán)格調(diào)控。不過(guò)，在整個(gè)細(xì)胞周期中，CDC6蛋白水平與其mRNA水平的變化趨勢(shì)并不一致，這表明翻譯后調(diào)控可能參與了CDC6蛋白水平的控制。CDC6可被多種E3泛素連接酶復(fù)合體泛素化，但它是否受到去泛素化酶（DUB）的直接調(diào)控，目前還不清楚.

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院鄒永新教授、史本康教授以及山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室武大雷教授和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院邢念增教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶OTUD6A介導(dǎo)了CDC6的去泛素化，OTUD6A通過(guò)上調(diào)CDC6來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。這項(xiàng)研究成果于近日發(fā)表在《Molecular Cancer》雜志上，為膀胱癌等癌癥的診斷和治療提供了新思路。

圖片來(lái)源：《Molecular Cancer》（https://doi.org/10.1186/s12943-024-01996-y）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)蛋白質(zhì)組范圍的DUB篩選來(lái)鑒定CDC6的潛在調(diào)節(jié)因子。為確定OTUD6A的功能，他們開(kāi)展了功能獲得和功能缺失實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)在多個(gè)癌細(xì)胞系上開(kāi)展，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則使用了條件性O(shè)tud6a基因敲除（CKO）小鼠（由賽業(yè)生物提供）。他們還利用N-丁基-N-(4-羥丁基)-亞硝胺（BBN）誘導(dǎo)了膀胱癌小鼠模型，以分析OTUD6A-CDC6軸在體內(nèi)的作用。

技術(shù)路線(xiàn)
01 通過(guò)蛋白質(zhì)組范圍的DUB篩選，發(fā)現(xiàn)OTUD6A對(duì)CDC6蛋白有明顯的上調(diào)作用
02 通過(guò)多種分析確定OTUD6A能夠直接與CDC6相互作用并逆轉(zhuǎn)其泛素化
03 體外和體內(nèi)分析表明，OTUD6A通過(guò)上調(diào)CDC6促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生
04 高水平的OTUD6A和CDC6與膀胱癌患者的預(yù)后不良有關(guān)

研究結(jié)果
1. OTUD6A正向調(diào)節(jié)CDC6的蛋白水平
為了系統(tǒng)地鑒定CDC6的潛在調(diào)節(jié)因子，研究人員開(kāi)展了蛋白質(zhì)組范圍的DUB篩選。他們發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶OTUD6A對(duì)CDC6蛋白水平具有最強(qiáng)的上調(diào)作用。在HEK293等細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)OTUD6A會(huì)增加CDC6的蛋白水平，但不會(huì)增加其mRNA水平。相反，使用shRNA對(duì)OTUD6A進(jìn)行敲降則會(huì)顯著降低CDC6蛋白水平，但對(duì)其mRNA水平?jīng)]有影響。

為了證實(shí)體內(nèi)OTUD6A對(duì)CDC6的調(diào)節(jié)作用，他們將Otud6aflox/flox小鼠（由賽業(yè)生物提供）與Dppa3-Cre小鼠雜交，產(chǎn)生了條件性O(shè)tud6a基因敲除（CKO）小鼠。與野生型小鼠相比，CKO小鼠的生長(zhǎng)曲線(xiàn)在出生后18天開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）增殖要慢得多，且CKO小鼠的大部分組織表現(xiàn)出較低的CDC6蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明，OTUD6A在體外和體內(nèi)都能正向調(diào)節(jié)CDC6的蛋白水平。

那么，OTUD6A與CDC6是否存在直接的相互作用？免疫熒光染色結(jié)果顯示，OTUD6A與CDC6共定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。免疫共沉淀分析證實(shí)，CDC6和OTUD6A在全細(xì)胞裂解液中相互共沉淀，且OTUD6A的N端區(qū)域介導(dǎo)了其與CDC6的相互作用。雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）等分析也證實(shí)了兩者之間存在直接的相互作用。更重要的是，它們之間的相互作用在S期晚期被檢測(cè)到，且主要發(fā)生在G2/M期，與CDC6蛋白水平的變化趨勢(shì)相同。

2. OTUD6A去除CDC6上的多泛素鏈并維持CDC6的穩(wěn)定性
考慮到OTUD6A在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)CDC6的表達(dá)，研究人員首先研究了OTUD6A對(duì)CDC6蛋白穩(wěn)定性的影響。在OTUD6A過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，CDC6蛋白的半衰期延長(zhǎng)，而敲降或敲除OTUD6A則導(dǎo)致其半衰期縮短（圖1），這表明OTUD6A抑制了CDC6的降解。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑MG132的處理能夠有效恢復(fù)OTUD6A敲降所導(dǎo)致的CDC6蛋白水平下降，表明OTUD6A可能通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)CDC6蛋白的穩(wěn)定性。

去泛素化酶通過(guò)去除泛素鏈來(lái)維持底物的穩(wěn)定性。體外去泛素化分析證實(shí)，OTUD6A可去除CDC6上的多泛素鏈；相反，敲降OTUD6A會(huì)增加CDC6的多泛素化（圖1）。研究人員還發(fā)現(xiàn)，OTUD6A的去泛素化酶死亡突變體（C152A突變體）失去了上調(diào)CDC6蛋白的能力，也未能減少內(nèi)源性和外源性CDC6的多泛素化。后續(xù)分析還顯示，OTUD6A去除了CDC6上K6、K33和K48連接的多泛素鏈。這些數(shù)據(jù)表明，OTUD6A可維持CDC6的穩(wěn)定性，并逆轉(zhuǎn)APC/C-CDH1和SCF-Cyclin F引起的CDC6降解。
 

圖1 OTUD6A去除CDC6上的多泛素鏈并維持CDC6的穩(wěn)定性[1]

3. OTUD6A-CDC6軸促進(jìn)了癌細(xì)胞的致瘤性
研究人員推測(cè)，OTUD6A可能像CDC6一樣，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用。于是他們分析了OTUD6A在細(xì)胞周期進(jìn)程中的表達(dá)。結(jié)果顯示，U2OS細(xì)胞中的OTUD6A蛋白水平隨著細(xì)胞周期波動(dòng)，在G2/M期達(dá)到峰值，然后在G1和S期下降。而且，內(nèi)源性O(shè)TUD6A蛋白水平與CDC6的水平相當(dāng)一致。此外，抑制OTUD6A或敲降CDC6都會(huì)導(dǎo)致G2/M期延遲，而過(guò)表達(dá)CDC6可減弱敲降OTUD6A誘導(dǎo)的G2/M期延遲，這表明OTUD6A以依賴(lài)CDC6的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。

根據(jù)這些結(jié)果，研究人員進(jìn)一步推測(cè)，OTUD6A可能是一種致癌基因。他們發(fā)現(xiàn)，OTUD6A在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)遠(yuǎn)高于尿路上皮細(xì)胞。CCK8、克隆形成和EdU摻入等實(shí)驗(yàn)表明，OTUD6A的敲降可抑制癌細(xì)胞的增殖，而過(guò)表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖（圖2）。腫瘤異種移植小鼠模型上的結(jié)果也表明，敲降癌細(xì)胞中的OTUD6A能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)，體外和體內(nèi)的CDC6異位表達(dá)能夠有效逆轉(zhuǎn)OTUD6A敲降介導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)抑制。這些結(jié)果表明，OTUD6A通過(guò)上調(diào)CDC6而促進(jìn)人類(lèi)癌細(xì)胞的致瘤性。

此外，研究人員還采用了BBN誘導(dǎo)的膀胱癌小鼠模型，這是探索膀胱腫瘤發(fā)生機(jī)制的常用方法。IHC染色顯示，OTUD6A、CDC6和Ki-67蛋白水平隨著B(niǎo)BN處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，表明OTUD6A和CDC6可能在膀胱腫瘤發(fā)生中起作用。值得注意的是，OTUD6A的敲除會(huì)導(dǎo)致BBN處理后膀胱腫瘤發(fā)生減少、惡性程度降低及CDC6蛋白水平降低（圖2），表明OTUD6A的敲除能夠抑制化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的膀胱腫瘤發(fā)生和CDC6蛋白表達(dá)。

圖2 OTUD6A-CDC6軸促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[1]

DNA損傷應(yīng)答（DDR）的增強(qiáng)是細(xì)胞化療耐藥的重要機(jī)制之一。CDC6被認(rèn)為是促進(jìn)DDR激活的一個(gè)重要因素�？紤]到OTUD6A能夠穩(wěn)定CDC6蛋白，研究人員接下來(lái)分析了OTUD6A是否也在DDR和化療應(yīng)答中發(fā)揮作用。通過(guò)體外和體內(nèi)分析，他們發(fā)現(xiàn)OTUD6A的抑制會(huì)提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，且OTUD6A的敲降或敲除也會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的DNA損傷。進(jìn)一步分析表明，OTUD6A促進(jìn)CDC6-ATR-Chk1信號(hào)通路的活性，并賦予腫瘤細(xì)胞化療耐藥性。

4. 高水平的OTUD6A和CDC6與癌癥預(yù)后不良有關(guān)
最后，研究人員分析了OTUD6A介導(dǎo)的CDC6上調(diào)是否具有潛在的臨床意義。他們檢測(cè)了20例人類(lèi)膀胱癌組織和癌旁正常組織中OTUD6A和CDC6的表達(dá)水平。膀胱癌組織中OTUD6A和CDC6的蛋白和mRNA水平均高于匹配的正常膀胱組織，且CDC6蛋白水平與OTUD6A蛋白水平呈正相關(guān)。

他們還觀察到，若膀胱癌患者的OTUD6A或CDC6水平相對(duì)較高，則總生存期（OS）較差。值得注意的是，OTUD6A和CDC6的聯(lián)合高水平與膀胱癌患者預(yù)后較差有更強(qiáng)的相關(guān)性，OTUD6A水平高而CDC6水平低的患者比OTUD6A水平低而CDC6水平高的患者有更好的預(yù)后。這些數(shù)據(jù)表明，OTUD6A-CDC6軸在膀胱癌中被優(yōu)先激活，其水平與患者生存期較差相關(guān)。因此，他們認(rèn)為，OTUD6A和CDC6可作為膀胱癌患者的一組預(yù)后標(biāo)志物。

研究結(jié)論

圖3 OTUD6A-CDC6軸調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和DNA損傷應(yīng)答機(jī)制的示意圖[1]

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)OTUD6A是CDC6的新型正向調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、機(jī)體生長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生、DNA損傷應(yīng)答以及化療敏感性中發(fā)揮重要作用（圖3），有助于人們?nèi)�面了解OTUD6A的生理和病理功能。這些數(shù)據(jù)還表明，OTUD6A-CDC6軸有望作為癌癥治療的臨床靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：[1]Cui, J., Liu, X., Shang, Q. et al. Deubiquitination of CDC6 by OTUD6A promotes tumour progression and chemoresistance. Mol Cancer 23, 86 (2024). https://doi.org/10.1186/s12943-024-01996-y

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建

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品系名稱(chēng)：C57BL/6NCya-Otud6aem1/Cya
產(chǎn)品編號(hào)： S-KO-10028
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品系名稱(chēng)：C57BL/6NCya-Otud6aem1flox/Cya
產(chǎn)品編號(hào)： S-CKO-11206
應(yīng)用方向：神經(jīng),代謝,行為學(xué)等