腸道中含有大量的淋巴組織和散布其中的免疫細(xì)胞。2型固有淋巴細(xì)胞（ILC2）作為重要的先天性免疫細(xì)胞群體，在多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括組織穩(wěn)態(tài)和組織修復(fù)、過(guò)敏性炎癥、代謝調(diào)節(jié)和抗蠕蟲(chóng)免疫。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽在調(diào)節(jié)抗蠕蟲(chóng)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腸道內(nèi)除了有密集的免疫細(xì)胞，還受到神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛支配。腸道內(nèi)在神經(jīng)元（iEN）的胞體位于腸道內(nèi)，能夠形成神經(jīng)回路，表現(xiàn)出自主反射活動(dòng)。不過(guò)，iEN在蠕蟲(chóng)感染過(guò)程中是否被激活、如何被激活以及背后潛在的神經(jīng)免疫相互作用仍不清楚。

清華大學(xué)朱可可研究員和西湖大學(xué)徐和平研究員領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)近日發(fā)現(xiàn)，在蠕蟲(chóng)感染期間，ILC2通過(guò)IL-13受體激活iEN，導(dǎo)致iEN產(chǎn)生β-CGRP，進(jìn)而抑制ILC2反應(yīng)和抗蠕蟲(chóng)免疫。這項(xiàng)成果于2025年1月30日發(fā)表在《Immunity》雜志上，揭示了腸道內(nèi)過(guò)去未知的雙向神經(jīng)免疫交互，這種交互會(huì)影響病原體的清除。
 

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了多個(gè)小鼠品系，包括Il13ra1報(bào)告基因小鼠（由賽業(yè)生物提供）、Nmur1^Cre/+iDTR小鼠、Rag2^-/-γc^-/-小鼠（缺乏ILC2）、Il13^△Nmur1小鼠和Il13ra1^△Actl6b小鼠等。他們還使用腺相關(guān)病毒（AAV-MaCPNS2）來(lái)特異性靶向iEN。他們利用巴西日?qǐng)A線蟲(chóng)（Nippostrongylus brasiliensis）感染小鼠，并對(duì)小鼠的iEN開(kāi)展單細(xì)胞核RNA測(cè)序（snRNA-seq）分析。

技術(shù)路線
利用線蟲(chóng)感染小鼠，確定iEN在感染后是否被激活以及哪些亞群被激活
↓
通過(guò)多個(gè)小鼠模型證實(shí)ILC2和IL-13是蠕蟲(chóng)感染后iEN激活所必需的
↓
利用cKO小鼠證實(shí)IL-13R信號(hào)傳導(dǎo)可抑制ILC2介導(dǎo)的抗蠕蟲(chóng)免疫
↓
通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)iEN在IL-13刺激下上調(diào)β-CGRP的表達(dá)并抑制ILC2反應(yīng)

研究結(jié)果
iEN在蠕蟲(chóng)感染后激活

為了檢測(cè)iEN在蠕蟲(chóng)感染后是否被激活，研究人員分析了小腸iEN中c-FOS的表達(dá)，這是神經(jīng)元激活的分子標(biāo)志物。在未感染的小鼠中，只有少量iEN表達(dá)c-FOS，不過(guò)在感染線蟲(chóng)7天后，小腸各個(gè)部分（十二指腸、空腸和回腸）的c-FOS⁺ iEN比例都顯著升高（圖1）。此外，iEN在感染后激活的時(shí)間模式也與小鼠體內(nèi)線蟲(chóng)的生命周期相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，iEN會(huì)對(duì)蠕蟲(chóng)感染做出反應(yīng)，并逐步激活。

為了確定哪些iEN亞群在線蟲(chóng)感染后激活，他們開(kāi)展了單細(xì)胞核RNA測(cè)序分析。結(jié)果顯示有16個(gè)iEN亞群，其中，內(nèi)在初級(jí)傳入神經(jīng)元亞群1和2（IPAN1 & 2）的轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了重大變化（圖1）。通過(guò)分析snRNA-seq數(shù)據(jù)集中已知配體受體對(duì)的表達(dá)模式，他們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽Calcb（編碼β-CGRP）和細(xì)胞因子受體Il13ra1的表達(dá)集中在IPAN1。

此外，iEN顯著上調(diào)了Calcb而非Calca（編碼α-CGRP）的表達(dá)。研究人員還委托賽業(yè)生物構(gòu)建了Il13ra1報(bào)告基因（Il13ra1^{iCre-TdTomato}）小鼠品系。在小鼠感染線蟲(chóng)后，IL-13RA1⁺ iEN中c-FOS陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯高于IL-13RA1^- iEN。這些數(shù)據(jù)表明，IL-13R⁺ iEN參與了蠕蟲(chóng)感染后的反應(yīng)，其特征是β-CGRP表達(dá)上調(diào)。
 

圖1. iEN在蠕蟲(chóng)感染后激活

ILC2是蠕蟲(chóng)感染后iEN激活所必需的
IL-13在蠕蟲(chóng)感染后的免疫反應(yīng)中起主導(dǎo)作用。研究人員通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)IL-13能夠直接激活iEN，導(dǎo)致c-FOS⁺ iEN比例顯著增加。在線蟲(chóng)感染期間，ILC2是IL-13的主要來(lái)源。在體外將iEN與ILC2共培養(yǎng)可顯著提高c-FOS⁺ iEN的比例。這表明，在蠕蟲(chóng)感染的情況下，ILC2可能通過(guò)產(chǎn)生IL-13參與體內(nèi)iEN的激活。

為了探究ILC2是否是體內(nèi)iEN最佳激活所必需的，他們構(gòu)建了Nmur1^Cre/+iDTR小鼠，利用白喉毒素來(lái)殺死ILC2。與對(duì)照組iDTR小鼠相比，Nmur1^Cre/+iDTR小鼠感染線蟲(chóng)后的c-FOS⁺ iEN比例顯著降低。為了進(jìn)一步證實(shí)ILC2在iEN激活中的作用，他們還研究了缺乏ILC2的Rag2^-/-γc^-/-小鼠。在過(guò)繼轉(zhuǎn)移ILC2之后，Rag2^-/-γc^-/-小鼠感染線蟲(chóng)后的c-FOS⁺ iEN比例明顯高于對(duì)照小鼠。此外，研究人員還構(gòu)建了Il13^△Nmur1小鼠（敲除ILC2中的Il13），證實(shí)了ILC2產(chǎn)生的IL-13是蠕蟲(chóng)感染后iEN激活所必需的。這些結(jié)果表明，ILC2和IL-13在蠕蟲(chóng)感染后促進(jìn)iEN激活方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

IL-13R信號(hào)傳導(dǎo)抑制ILC2介導(dǎo)的抗蠕蟲(chóng)免疫
為了研究IL-13R信號(hào)傳導(dǎo)在iEN激活和功能中的作用，研究人員特異性敲除了神經(jīng)元中的Il13ra1，構(gòu)建了Il13ra1^△Actl6b小鼠。在比較對(duì)照小鼠和cKO小鼠的snRNA-seq數(shù)據(jù)后，他們觀察到IPAN1和2亞群發(fā)生了很大的轉(zhuǎn)錄變化。值得注意的是，對(duì)照小鼠和cKO小鼠之間IPAN1的差異表達(dá)基因與感染小鼠和未感染小鼠之間的差異表達(dá)基因基本重疊。他們還發(fā)現(xiàn)IL-13RA1缺失顯著降低了IPAN1的特征評(píng)分。具體來(lái)說(shuō)，感染誘導(dǎo)的Calcb上調(diào)在IL-13RA1缺陷型IPAN1中顯著減少。這些結(jié)果表明，IL-13RA1是iEN在線蟲(chóng)感染后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄重編程所必需的。

他們還觀察到，與對(duì)照小鼠相比，Il13ra1^△Actl6b小鼠感染線蟲(chóng)后腸系膜淋巴結(jié)（mLN）中總ILC2、產(chǎn)生IL-13的ILC2和Ki-67⁺ ILC2的比例和數(shù)量都顯著增加，但CD4⁺ T細(xì)胞比例保持不變（圖2）。同時(shí)，在感染線蟲(chóng)后，Il13ra1^△Actl6b小鼠的小腸中出現(xiàn)更多ILC2。這些小鼠表現(xiàn)出杯狀細(xì)胞過(guò)度增生，且蠕蟲(chóng)負(fù)荷明顯降低（圖2）。這些數(shù)據(jù)表明，IL-13R信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)iEN的最佳激活至關(guān)重要，而iEN的激活反過(guò)來(lái)又會(huì)抑制ILC2的免疫反應(yīng)，可能避免對(duì)宿主不利的過(guò)度炎癥。

圖2. 神經(jīng)IL-13R信號(hào)傳導(dǎo)抑制ILC2抗蠕蟲(chóng)免疫

為了進(jìn)一步驗(yàn)證iEN內(nèi)源性IL-13R信號(hào)傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)抗蠕蟲(chóng)免疫中的作用，研究人員接下來(lái)利用一種腺相關(guān)病毒（AAV-MaCPNS2）來(lái)特異性靶向iEN。與WT^AAV小鼠相比，Il13-ra1^AAV小鼠感染線蟲(chóng)后的c-FOS+ iEN比例明顯降低，而mLN中的總ILC2比例和數(shù)量顯著增加，其中iILC2比例較高，nILC2比例較低。與ILC2反應(yīng)增強(qiáng)一致的是，Il13-ra1^AAV小鼠小腸中的杯狀細(xì)胞過(guò)度增生，且蠕蟲(chóng)負(fù)荷顯著降低。這些結(jié)果表明，iEN內(nèi)源性IL-13R對(duì)蠕蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的炎癥做出反應(yīng)，隨后抑制ILC2介導(dǎo)的抗蠕蟲(chóng)免疫。

iEN通過(guò)β-CGRP抑制ILC2的反應(yīng)
研究人員假設(shè)，iEN中的IL-13R信號(hào)傳導(dǎo)可能會(huì)上調(diào)β-CGRP的表達(dá)，進(jìn)而抑制ILC2反應(yīng)。為了證明這一點(diǎn)，他們從Il13ra1^fl/fl小鼠或Il13ra1^△Actl6b小鼠的小腸中分離出iEN，并在IL-13存在的情況下對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)。他們觀察到從Il13ra1^fl/fl小鼠中分離的iEN誘導(dǎo)了Calcb的表達(dá)，但從Il13ra1^△Actl6b小鼠中分離的iEN沒(méi)有。他們還觀察到， Il13ra1^fl/f小鼠（而非Il13ra1^△Actl6b小鼠）在感染線蟲(chóng)后iEN中的CGRP蛋白表達(dá)增加。這些結(jié)果表明，iEN對(duì)IL-13刺激做出反應(yīng)，隨后上調(diào)β-CGRP的表達(dá)。

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)β-CGRP是否能直接抑制ILC2反應(yīng)，他們從小腸中分選并純化了ILC2，并在體外培養(yǎng)。值得注意的是，β-CGRP能夠顯著抑制IL-13的產(chǎn)生和ILC2的增殖。此外，給小鼠注射β-CGRP后，Il13ra1^fl/f小鼠和Il13ra1^△Actl6b小鼠在感染線蟲(chóng)后不再表現(xiàn)出ILC2反應(yīng)、杯狀細(xì)胞增生和蠕蟲(chóng)清除。這些結(jié)果表明，β-CGRP參與了iEN介導(dǎo)的ILC2抗蠕蟲(chóng)免疫的抑制作用。

結(jié)論

圖3. 雙向的神經(jīng)免疫交互

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究為腸道中的雙向神經(jīng)免疫交互提供了直接證據(jù)�？紤]到越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)免疫相互作用參與了慢性炎癥性疾病、代謝健康和癌癥，研究人員認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了確定交互途徑的重要性，未來(lái)有助于開(kāi)發(fā)新一代的預(yù)防和治療策略。

原文檢索
Wang et al., Bi-directional communication between intrinsic enteric neurons and ILC2s inhibits host defense against helminth infection, Immunity (2025), https://doi.org/10.1016/j.immuni.2025.01.004