導(dǎo)讀

在傳統(tǒng)微生物代謝研究中，同位素標(biāo)記法是探索細(xì)胞/細(xì)菌特定代謝進(jìn)程的常用手段。由于同位素會影像生物大分子的化學(xué)震動，科研工作者可以通過紅外光譜成像對含有同位素的微生物或細(xì)胞進(jìn)行紅外檢測。但是傳統(tǒng)紅外的分辨率有限，致使多數(shù)研究只能聚焦于細(xì)胞群落層面，難以深入至單個(gè)細(xì)胞。基于新型光學(xué)光熱紅外 (O-PTIR) 化學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，為該領(lǐng)域帶來了重要轉(zhuǎn)機(jī)。該技術(shù)大幅提升了傳統(tǒng)紅外化學(xué)成像的空間分辨率，能夠在亞微米空間尺度下，依據(jù)化學(xué)特征，對不同物質(zhì)進(jìn)行特異性化學(xué)成像。借助O-PTIR技術(shù)，科研人員不僅能對的同位素標(biāo)記的微生物進(jìn)行紅外波譜分析，還能對同位素的單個(gè)微生物、細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)成像，為微生物單細(xì)胞代謝研究提供更為豐富、詳盡的信息。

新一代化學(xué)成像顯微鏡

美國PSC公司研發(fā)的新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage，大大地拓展了光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用。該設(shè)備基于新型光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)，能夠?qū)ξ镔|(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)成像，解決了傳統(tǒng)化學(xué)成像空間分辨率低的問題，其化學(xué)成像分辨高達(dá)500 nm，可在亞微米尺度上對單個(gè)細(xì)胞、微生物內(nèi)同位素標(biāo)記物進(jìn)行成像與波譜分析。同時(shí)，該系統(tǒng)還兼具拉曼波譜，可以對同一個(gè)樣品進(jìn)行紅外/拉曼共定位分析，為微生物代謝組學(xué)、微生物藥物組學(xué)、藥學(xué)等多個(gè)生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供了新的表征手段。

新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage

mIRage的特有優(yōu)勢：

• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼高光譜成像（~500 nm）；
• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；
• 非接觸測量模式—使用簡單快捷，無交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；
• 很少或無需樣品制備過程(無需薄片), 可測試厚樣品；
• 可透射模式下觀察溶液中的樣品；
• 實(shí)現(xiàn)同時(shí)同地相同分辨率的IR和Raman測試；
• 熒光顯微成像實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記樣品快速定位。

mIRage部分同位素成像應(yīng)用

一、mIRage助力單細(xì)胞水平同位素成像研究細(xì)菌代謝

英國利物浦大學(xué)Roy Goodacre教授發(fā)表了關(guān)于同位素標(biāo)記的細(xì)菌振動光譜研究成果。該研究借助于新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage，通過紅外光譜和成像分析，揭示了細(xì)菌代謝的過程和機(jī)理，不僅包含細(xì)菌群落，還包含微生物之間的相互作用。該成果創(chuàng)新性的運(yùn)用新型光學(xué)光熱紅外 (O-PTIR) 化學(xué)成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞水平上準(zhǔn)確評估細(xì)菌對標(biāo)記化合物的吞并行為過程，為細(xì)菌代謝研究開辟了新的途徑。

二、 mIRage高分辨率表征助力細(xì)菌耐藥性研究

近期，mIRage的高空間分辨率和光譜質(zhì)量又助力一科研團(tuán)隊(duì)通過氘同位素標(biāo)記在單細(xì)胞水平上快速鑒定抗菌素耐藥性。在該研究中，作者采用了光學(xué)光熱紅外 (O-PTIR) 化學(xué)成像技術(shù)的非破壞性表型分析方法，結(jié)合氘同位素探測 (DIP) 和多元統(tǒng)計(jì)分析作為代謝指紋識別方法，在單細(xì)胞和群體水平上檢測尿路致病大腸桿菌中的抗生素耐藥性。

下圖為未處理和甲氧芐啶TMP處理?xiàng)l件下生長的兩種大腸桿菌分離株（上圖A和D為光學(xué)成像）的 O-PTIR成像。未處理（圖A）和 TMP 處理（圖D）大腸桿菌細(xì)胞（分離株 147，TMP 敏感）的光學(xué)圖像突出顯示了單個(gè)細(xì)胞的位置。在未處理（圖B）和TMP處理（圖E）條件下生長的這些細(xì)菌細(xì)胞在蛋白質(zhì)酰胺 I 帶的1,655 cm^-1峰進(jìn)行紅外成像，也顯示出與背景的明顯對比。然而，在同一視野下，使用 2,163 cm^-1 處的峰值（歸因于 C-D 振動），未經(jīng)處理的TMP敏感大腸桿菌細(xì)胞（圖C）清晰可見，表明它們具有代謝活性并吸收了氘，而TMP處理的細(xì)胞幾乎未被檢測到，表明它們不具有代謝活性，因此不能吸收氘（圖F）。

通過O-PTIR 光譜數(shù)據(jù)鑒別由于氘摻入細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致的明顯光譜偏移 (C-D 特征峰)，從而可以在單細(xì)胞水平上快速檢測和分類敏感和耐藥分離株，并發(fā)現(xiàn)了甲氧芐啶敏感菌株在暴露于這種抗生素時(shí)攝入氘的能力降低。本研究的結(jié)果表明mIRage是一種可在單細(xì)胞水平上快速檢測抗生素抗藥性的有效工具。

三、mIRage協(xié)助研究單細(xì)胞水平的多種同位素的光譜變化

mIRage紅外光譜協(xié)助科研工作者在單細(xì)胞水平上研究碳-氘動力學(xué)和同位素光譜偏移。在該研究中，團(tuán)隊(duì)采用了多種重穩(wěn)定同位素 (D、¹³C、¹⁵N 和 ¹⁸O) 組合，使用光學(xué)光熱紅外 (O-PTIR) 化學(xué)成像技術(shù)在單細(xì)胞水平上評估中紅外區(qū)域所有可能的同位素光譜偏移。

如下圖所示，由于重同位素?fù)饺肓烁鞣N生物分子，通過mIRage可以觀察到多種同位素組會導(dǎo)致的多種振動峰的幾個(gè)光譜偏移。單個(gè)大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞的 O-PTIR 光譜數(shù)據(jù)在所有含有重水的條件下都顯示出兩個(gè)不同的峰（Csingle bondD 特征峰），包括D₂O（圖A）、¹³C + D₂O（圖B）、¹⁵N + D₂O（圖C）和 ¹³C + ¹⁵N + D₂O（圖D）。在同時(shí)含有 ¹³C 和 D₂O 的條件下，在 ¹³C + D₂O（圖B）以及¹³C + ¹⁵N + D₂O（圖D）條件下，對稱 CD₃（從 2,213 cm^-1 到 2,198 cm^-1）和對稱 CD2（2175 cm^-1 到 2163 cm^-1）中觀察到了額外的偏移。

這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，O-PTIR 可以作為監(jiān)測單個(gè)細(xì)菌中多種同位素標(biāo)記的有效工具。

總結(jié)

在上述案例中，mIRage展現(xiàn)了能夠?qū)�單個(gè)微生物內(nèi)同位素標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行高分辨化學(xué)成像的能力。這意味著它不僅可以準(zhǔn)確捕獲單個(gè)細(xì)胞、微生物內(nèi)同位素標(biāo)記的圖像，也可以對單個(gè)細(xì)胞的同位素藥物攝入過程進(jìn)行表征。尤其值得注意的是，面對同一細(xì)胞內(nèi)多種同位素并存的復(fù)雜情況，mIRage也能實(shí)現(xiàn)特異性表征，準(zhǔn)確地反饋特定物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布與化學(xué)變化。

憑借上述超卓的性能，mIRage在微生物代謝組學(xué)、微生物藥物代謝、藥學(xué)等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，能夠?yàn)榭蒲泄ぷ髡咛峁┎灰粯拥难芯恳暯呛蜏?zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

除了上述應(yīng)用外，mIRage這一熒光、紅外、拉曼三合一的化學(xué)成像顯微還在多個(gè)科研領(lǐng)域有所應(yīng)用：

1.  環(huán)境微塑料

微塑料顆粒（~600 nm）的O-PTIR光譜及成像分析
(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)

2. 高分子材料

1210 cm^-1處采集的PP/PTFE的O-PTIR光譜和顯微圖像
(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)

3. 半導(dǎo)體

薄膜晶體管顯示器中污染物的O-PTIR分析

器件表面缺陷的紅外和拉曼光譜同步（同時(shí)間、同位置）分析
(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)

4. 生命科學(xué)

腦組織的明場顯微圖像、O-PTIR光譜及成像分析

5. 文物鑒定

柯羅19世紀(jì)繪畫作品中鋅皂異質(zhì)性的O-PTIR顯微光譜及成像分析
(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)

mIRage國內(nèi)部分發(fā)表文章一覽

☛ 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)借助mIRage成功實(shí)現(xiàn)對玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

☛ 中科院過程工程研究所使用mIRage對利拉魯肽微球的藥物與載藥顆粒的化學(xué)成分與空間分布進(jìn)行了鑒定，該成果發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces上。

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1、非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)—mIRage（材料領(lǐng)域）
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