在生命科學領(lǐng)域，對器官三維結(jié)構(gòu)的精準解析一直是探索生理與病理機制的核心目標。傳統(tǒng)組織學方法依賴二維切片重建，難以完整保留器官結(jié)構(gòu)且易受操作變形影響。而新興的組織透明化技術(shù)結(jié)合光片顯微鏡，為解決這一難題提供了全新路徑。2017年發(fā)表于《Scientific Reports》的一項研究，通過改良的CUBIC組織透明化方法，成功實現(xiàn)了小鼠子宮內(nèi)胚胎與胎盤的三維可視化，為深入理解胎盤發(fā)育及相關(guān)疾病機制奠定了基礎(chǔ)。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)組織學方法的局限性
在該研究之前，科研人員主要依靠傳統(tǒng)的組織切片和染色技術(shù)來分析子宮和胎盤的結(jié)構(gòu)。這些方法需要制備大量連續(xù)的薄組織切片，然后通過染色來觀察細胞和組織結(jié)構(gòu)。然而，這種方法存在明顯的局限性。首先，在切片過程中，組織很容易發(fā)生變形。其次，染色過程也可能破壞組織的完整性。染色劑可能無法均勻地滲透到組織的各個部分，導致某些區(qū)域的染色效果不佳，影響對細節(jié)的觀察。此外，通過二維切片來重建三維結(jié)構(gòu)是一項非常復雜且耗時的工作。因此，傳統(tǒng)方法在分析子宮和胎盤的三維結(jié)構(gòu)時面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

子宮與胎盤的結(jié)構(gòu)特殊性
子宮和胎盤的結(jié)構(gòu)具有很強的特殊性，這使得傳統(tǒng)的成像方法難以有效應用。子宮是一個肌肉豐富的器官，其肌肉組織的存在會對光線的穿透造成阻礙。而胎盤則是一個血管密集的器官，富含血液和血管，這使得光線在穿透胎盤時會被大量吸收和散射，導致成像效果不佳。具體來說，子宮的肌肉組織中含有大量的肌紅蛋白，而胎盤的血管中含有大量的血紅蛋白。這些色素分子會吸收特定波長的光線，使得傳統(tǒng)的光學成像技術(shù)難以穿透這些組織，從而無法獲取清晰的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖像。

技術(shù)創(chuàng)新與應用
CUBIC方法的改良與優(yōu)勢
在這項研究中，科研人員選擇了CUBIC方法，并對其進行了改良，以適應子宮和胎盤的特殊結(jié)構(gòu)。CUBIC方法的核心在于其獨特的試劑配方，能夠有效地去除組織中的色素分子，如血紅蛋白和肌紅蛋白，同時保持組織的完整性和熒光標記的穩(wěn)定性。

CUBIC試劑由多種成分組成，這些成分相互作用，能夠溶解和去除組織中的脂類和色素，同時保持組織的三維結(jié)構(gòu)。與其他組織透明化方法相比，CUBIC方法具有明顯的優(yōu)勢。首先，它能夠高效地去除子宮和胎盤中的血紅蛋白和肌紅蛋白，使組織變得透明，從而允許光線穿透，進行三維成像。其次，CUBIC方法對組織的損傷較小，能夠較好地保持組織的結(jié)構(gòu)和抗原性，為后續(xù)的免疫組織化學染色等分析提供了可能。此外，CUBIC方法的處理時間相對較短，能夠在較短的時間內(nèi)完成組織透明化處理，提高了實驗效率。

光片顯微鏡的優(yōu)勢在于其能夠在較短的時間內(nèi)獲取高分辨率的三維圖像，同時對樣本的損傷較小。這使得它非常適合用于對活體樣本或脆弱的組織樣本進行成像。在這項研究中，光片顯微鏡被用于對透明化的子宮和胎盤進行成像，成功獲取了胚胎和胎盤的三維結(jié)構(gòu)圖像，為后續(xù)的分析提供了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

成像實驗與結(jié)果分析
實驗流程與關(guān)鍵步驟
樣本制備：實驗選用了不同孕期的小鼠子宮和胎盤作為研究對象。首先，對小鼠進行深度麻醉，然后通過心臟灌注4%多聚甲醛（PFA）/磷酸鹽緩沖液（PBS）和碘化丙啶（PI）溶液，對組織進行固定和染色。固定完成后，將子宮和胎盤組織分離出來，進一步在4%PFA中浸泡過夜，以確保組織充分固定。

CUBIC透明化處理：將固定好的組織浸泡在CUBIC-1試劑中，在37°C下溫和振蕩處理3天。之后更換新鮮的CUBIC-1試劑，繼續(xù)處理2天。這一步驟的目的是去除組織中的脂類和色素，使組織變得透明。處理完成后，用PBS對組織進行3次清洗，每次清洗在室溫下溫和振蕩進行。接著，將組織浸泡在20%蔗糖的PBS溶液中1天，進行脫水處理。最后，將組織浸泡在CUBIC-2試劑中2天，進一步優(yōu)化組織的透明度和折射率。

光片顯微鏡成像：將透明化處理后的組織樣本置于光片顯微鏡下進行成像。使用物鏡獲取整個生殖器官的整體圖像、具有單細胞分辨率的詳細圖像。在成像過程中，使用638nm的激發(fā)波長來激發(fā)組織中的自發(fā)熒光信號，同時結(jié)合PI和EGFP的熒光標記，獲取高質(zhì)量的三維圖像。

圖像分析與處理：使用ZEN軟件對獲取的三維圖像進行分析和處理。通過三維重建和圖像處理技術(shù)，科研人員能夠從不同角度觀察子宮和胎盤的結(jié)構(gòu)，獲取各種截面圖像，并進行定量分析。

細胞核與特定細胞的定位：利用PI染色，科研人員成功標記了子宮和胎盤中的細胞核。通過三維成像，可以清晰地看到細胞核在組織中的分布情況，以及細胞的排列方式。此外，結(jié)合EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，科研人員能夠特異性地標記胚胎和胎盤的特定細胞，如滋養(yǎng)層細胞。通過觀察EGFP標記的細胞，科研人員能夠追蹤這些細胞在子宮內(nèi)的遷移路徑，以及它們與母體組織的相互作用。

免疫組織化學驗證：為了驗證成像結(jié)果的準確性，科研人員對透明化的組織樣本進行了免疫組織化學染色。他們選擇了血管內(nèi)皮標記物CD31和滋養(yǎng)層標記物細胞角蛋白-7（CK7）進行染色。在染色后的組織切片中，能夠清晰地觀察到CD31和CK7的陽性信號，這表明CUBIC透明化處理并沒有破壞組織的抗原性，為后續(xù)的免疫組織化學分析提供了可能。

總結(jié)與展望
通過改良CUBIC組織透明化技術(shù)與光片顯微鏡結(jié)合，首次實現(xiàn)了小鼠子宮內(nèi)胚胎與胎盤的三維可視化，突破了傳統(tǒng)組織學方法的局限。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的CUBIC方案能有效消除子宮肌紅蛋白和胎盤血紅蛋白的干擾，保留組織完整性，并通過PI染色和EGFP轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)細胞核與特定細胞的精準定位。光片顯微鏡的應用進一步提供了單細胞分辨率的三維成像能力，揭示了胚胎與胎盤在子宮內(nèi)的空間分布及動態(tài)發(fā)育過程，為胎盤血管重塑、滋養(yǎng)層細胞侵襲等關(guān)鍵機制研究奠定了基礎(chǔ)。

然而，PI在胚胎深部的染色效率不足，晚期胎盤組織的成像分辨率有待提升，且人類樣本的適用性尚未驗證。未來研究可聚焦于技術(shù)優(yōu)化，開發(fā)更高效的染色策略（如原位雜交或新型熒光探針），提升深層組織標記效果，探索CUBIC與超分辨顯微鏡的結(jié)合，突破光學衍射極限。

Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M. et al. Three-dimensional visualization of intrauterine conceptus through the uterine wall by tissue clearing method. Sci Rep 7, 5964 (2017).

DOI:10.1038/s41598-017-06549-6.