一、自噬簡(jiǎn)介

     

       1、大自噬（macroautophagy），也就是通常說(shuō)的自噬（autophagy），是真核細(xì)胞蛋白降解的途徑之一。自噬可以被描述為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的成分（細(xì)胞器、蛋白等）被雙層膜的囊泡包裹，形成自噬體（autophagosome），進(jìn)而傳遞到溶酶體進(jìn)行降解的過(guò)程。

      詳細(xì)來(lái)說(shuō)，自噬過(guò)程與內(nèi)涵體途徑（endolysosomal pathway）密不可分（見(jiàn)圖1）。一方面，自噬體能夠與晚期內(nèi)體（late endosome）融合形成中間囊泡（amphisome）最終形成自噬溶酶體（autolysosome）；另一方面，自噬體能夠直接與溶酶體（lysosome）融合形成自噬溶酶體。無(wú)論通過(guò)哪條途徑，自噬溶酶體最終通過(guò)酸性水解酶將細(xì)胞器、蛋白等消化分解。

      細(xì)胞本底水平的自噬發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，可保護(hù)細(xì)胞免受錯(cuò)誤折疊蛋白或受損細(xì)胞器的影響，從而防止某些疾病的發(fā)生（如神經(jīng)退行性疾病和癌癥）。饑餓等也可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，通過(guò)降解大分子物質(zhì)和細(xì)胞器為細(xì)胞活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)和能量。

 

圖1 自噬過(guò)程及其與內(nèi)涵體途徑的關(guān)系

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

 

2、自噬的調(diào)控

 

      雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在自噬反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，自噬反應(yīng)被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）未被抑制后，自噬反應(yīng)機(jī)制被啟動(dòng)。作為酵母中Atg1的同系物，三個(gè)相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶 UNC-51樣酶-1，-2，-3（ULK1, ULK2, UKL3），通過(guò)與mTOR復(fù)合物之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)自噬反應(yīng)。ULK1、ULK2、mAtg13和骨架蛋白FIP200（酵母Atg17的同系物）一起形成一個(gè)復(fù)雜的復(fù)合物。Class III PI3K復(fù)合物由hVps34, Beclin-1 (酵母 Atg6的同系物), p150 (酵母Vps15同系物), 和類(lèi)Atg14蛋白 (Atg14L or Barkor) 或者紫外線(xiàn)放射抗性相關(guān)蛋白UVRAG (ultraviolet irradiation resistance-associated gene )蛋白組成，其在誘導(dǎo)自噬反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。Atg基因通過(guò)形成Atg12-Atg5 and LC3-II (Atg8-II)復(fù)合物來(lái)調(diào)控自噬體的形成。在Atg7和Atg710（分別對(duì)應(yīng)泛素活化酶E1和泛素結(jié)合酶E2酶）的作用下，Atg12和Atg5之間通過(guò)一個(gè)類(lèi)泛素反應(yīng)結(jié)合形成Atg12-Atg5，Atg12-Atg5再通過(guò)非共價(jià)鍵與Atg16結(jié)合形成多聚體Atg12-Atg5-Atg16，參與自噬體的擴(kuò)張。在Atg4、 Atg7和Atg3的作用下，LC3轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-II-PE并緊密結(jié)合于自噬泡膜表面，參與前自噬體的延伸。

 

      自噬既能抑制也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩種反應(yīng)在生物體內(nèi)廣泛存在。在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬反應(yīng)作為一個(gè)細(xì)胞的促活反應(yīng)機(jī)制存在，但是過(guò)量的自噬反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但由自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上有明顯的不同。幾種促凋亡信號(hào)因子，如TNF, TRAIL, and FADD也會(huì)誘導(dǎo)自噬的反應(yīng)發(fā)生。此外，Bcl-2也是自噬反應(yīng)重要的調(diào)節(jié)因子，其為凋亡抑制蛋白，通過(guò)與Beclin-1結(jié)合形成復(fù)合物，來(lái)抑制由Beclin-1誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。

 

      線(xiàn)粒體自噬屬于選擇性自噬，其主要作用是降解細(xì)胞中損傷以及不需要的線(xiàn)粒體。當(dāng)線(xiàn)粒體損傷之后，在正常的線(xiàn)粒體中持續(xù)被降解的PINK蛋白（PARL促進(jìn)此反應(yīng)）會(huì)處于穩(wěn)定狀態(tài)，再通過(guò)E3連接酶Parkin的作用來(lái)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體自噬。Parkin會(huì)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜蛋白的聚泛素化，由此導(dǎo)致與LC3結(jié)合的自噬受體蛋白的SQSTM1/p62, NBR1, and Ambra1聚集。此外，在特定的細(xì)胞類(lèi)型中，同樣存在LC3結(jié)合區(qū)域（LIR）的BNIP3 和 BNIP3L/NIX直接通過(guò)泛素依賴(lài)型反應(yīng)機(jī)制也會(huì)聚集自噬反應(yīng)的相關(guān)因子，進(jìn)而促進(jìn)自噬體的形成。

 

3、LC3 

      LC3（light chain 3）簡(jiǎn)稱(chēng)于MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物。哺乳動(dòng)物中的LC3與酵母中的自噬相關(guān)蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

     LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸殘基，產(chǎn)生細(xì)胞漿定位的LC3-I。在自噬過(guò)程中，LC3-I會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）共價(jià)結(jié)合，形成LC3-II并定位于自噬體膜上（見(jiàn)圖3）。哺乳動(dòng)物中的LC3可分為三種： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作為L(zhǎng)C3的一種，同樣可以用作自噬的分子標(biāo)志。

 

圖3  LC3在自噬體形成中的作用

(Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012)

 

4、自噬流檢測(cè)方法

 

      細(xì)胞經(jīng)自噬誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬流的水平進(jìn)行觀察和檢測(cè)，常用的技術(shù)手段見(jiàn)表1：

 

表1 自噬體計(jì)數(shù)及自噬流檢測(cè)方法匯總

（Mizushima et al, Cell, 2010）

      其中，電鏡觀察法由于受到實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備的限制應(yīng)用范圍有限；而由于自噬過(guò)程發(fā)生快速，通過(guò)IB/WB檢測(cè)LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)的影響。

      想要準(zhǔn)確檢測(cè)自噬流的變化，需要多種技術(shù)手段共同使用，才能達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果，產(chǎn)生具有說(shuō)服性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

自噬雙標(biāo)產(chǎn)品 ：mCherry-GFP-LC3B腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相關(guān)病毒（AAV）

  

 mCherry-GFP-LC3B自噬雙標(biāo)系統(tǒng)的工作原理為： 未發(fā)生自噬的細(xì)胞及含有自噬體的細(xì)胞中，由于mCherry與GFP共同表達(dá)，細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光。當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，酸性的溶酶體環(huán)境使酸敏感的GFP熒光淬滅，而mCherry不受影響，進(jìn)而使自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光。因此，紅色熒光可指示自噬溶酶體形成的順利程度。紅色熒光越多，綠色熒光越少，則從自噬體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進(jìn)程受阻（見(jiàn)圖4和附圖）。

維真現(xiàn)推出mCherry-GFP-LC3B腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒，滿(mǎn)足您實(shí)驗(yàn)的不同需要。

·簡(jiǎn)便直觀，實(shí)現(xiàn)自噬可視化； 

·準(zhǔn)確指示，實(shí)現(xiàn)自噬流監(jiān)測(cè)。

 

 

 

自噬相關(guān)基因的病毒產(chǎn)品
自噬通路相關(guān)基因		表達(dá)載體		腺病毒載體		腺病毒
基因名稱(chēng)	基因編號(hào)	產(chǎn)品貨號(hào)	貨期	產(chǎn)品貨號(hào)	貨期	產(chǎn)品貨號(hào)	貨期
alfy	NM_014991	CH852478	非現(xiàn)貨	AH852478	非現(xiàn)貨	VH852478	非現(xiàn)貨
ulk1	NM_003565	CH808275	非現(xiàn)貨	AH808275	非現(xiàn)貨	VH808275	非現(xiàn)貨
sqstm1	NM_003900	CH858197	現(xiàn)貨	AH858197	現(xiàn)貨	VH858197	現(xiàn)貨
sqstm1	NM_001142298	CH808956	非現(xiàn)貨	AH808956	非現(xiàn)貨	VH808956	非現(xiàn)貨
p150	NM_005407	CH815035	現(xiàn)貨	AH815035	現(xiàn)貨	VH815035	非現(xiàn)貨
fip200	NM_014781	CH801228	非現(xiàn)貨	AH801228	非現(xiàn)貨	VH801228	非現(xiàn)貨
p150	NM_012414	CH895682	非現(xiàn)貨	AH895682	非現(xiàn)貨	VH895682	非現(xiàn)貨
ampk	NM_017431	CH885062	現(xiàn)貨	AH885062	現(xiàn)貨	VH885062	現(xiàn)貨
ampk	NM_002733	CH842000	現(xiàn)貨	AH842000	現(xiàn)貨	VH842000	現(xiàn)貨
ampk	NM_006253	CH818994	現(xiàn)貨	AH818994	現(xiàn)貨	VH818994	現(xiàn)貨
ampk	NM_006252	CH801722	現(xiàn)貨	AH801722	非現(xiàn)貨	VH801722	非現(xiàn)貨
ampk	NM_206907	CH805185	非現(xiàn)貨	AH805185	非現(xiàn)貨	VH805185	非現(xiàn)貨
pi3k	NM_001142633	CH888389	非現(xiàn)貨	AH888389	非現(xiàn)貨	VH888389	非現(xiàn)貨
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pi3k	NM_006219	CH814123	現(xiàn)貨	AH814123	現(xiàn)貨	VH814123	現(xiàn)貨
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pi3k	NM_004570	CH892216	現(xiàn)貨	AH892216	非現(xiàn)貨	VH892216	非現(xiàn)貨
pi3k	NM_002646	CH816369	非現(xiàn)貨	AH816369	非現(xiàn)貨	VH816369	非現(xiàn)貨
nbr1	NM_031862	CH824737	現(xiàn)貨	AH824737	現(xiàn)貨	VH824737	現(xiàn)貨
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pras40	NM_032375	CH882903	非現(xiàn)貨	AH882903	非現(xiàn)貨	VH882903	非現(xiàn)貨
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