1.組織透明化極大地改善了哺乳動物組織中的化學標記

作者對小鼠給藥脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）抑制劑PF7845-yne（末端含炔基），通過CuAAC點擊化學反應(yīng)，炔基與熒光標簽的疊氮化物反應(yīng)形成疊氮炔環(huán)，進而引入熒光基團。初始試圖直接成像藥物結(jié)合的FAAH，但由于信噪比較差，未能顯示細胞靶標。因而猜測腦組織構(gòu)成復雜，其致密的脂膜可能影響點擊化學反應(yīng)，作者測試了基于聚丙烯酰胺的水凝膠組織透明化方法CLARITY，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除脂質(zhì)后顯著提升了成像的信噪比（圖1C、D）。作者同時也驗證了其他的透明化方法也得到了類似的效果（圖1E）。此外，作者還比較了不同的點擊化學配體（TBTA，BTTAA，BTTP）及不同的銅離子濃度下的反應(yīng)效率，發(fā)現(xiàn)使用BTTP，150 μM硫酸銅條件下可獲得高信噪比且穩(wěn)定的成像（圖1B）。

2.CATCH實現(xiàn)了藥物-靶點接觸的全腦、亞細胞原位成像

為了驗證CATCH應(yīng)用的廣泛性，作者對三種小分子藥物FAAH抑制劑PF7845-yne、BIA10-2474-yne和單胺氧化酶（MAO）抑制劑Pargyline-yne進行CATCH成像，結(jié)果清晰展示了藥物-靶點在小鼠不同腦區(qū)的分布（圖2A-E）。另外，還可以展示這些分子主要靶向的細胞類型，F(xiàn)AAH抑制劑主要靶向新皮質(zhì)和海馬中的神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu);而Pargyline-yne主要結(jié)合全腦的血管樣結(jié)構(gòu)，少量下丘腦和腦橋內(nèi)稀疏但特異標記的神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)（圖2F）。

圖2 全腦藥物結(jié)合的可視化
 

2.CATCH可與熒光標記復合以識別靶細胞類型

作者在給藥處理后進行NeuN免疫染色，發(fā)現(xiàn)PF7845-yne和BIA10-2474-yne主要與新皮質(zhì)、海馬和杏仁核中的NeuN+神經(jīng)元共定位。而在腦橋中發(fā)現(xiàn)了一小群神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)，它們是NeuN陰性但被 pargyline-yne 靶向的（圖3A-D）。隨后作者洗脫NeuN并重新孵育TH抗體驗證該推測，確定了NeuN-，Pargyline-yne陽性的細胞的確是LC-NA神經(jīng)元（圖3E）。由此證明，CATCH可以和熒光標記結(jié)合揭示了藥物結(jié)合的細胞類型，并且可以區(qū)分神經(jīng)元不同部分的藥物靶標參與位點，可以支持多輪的藥物靶向細胞類型鑒定。

圖3 藥物靶點的細胞型鑒定

锘海團隊自主研發(fā)的組織透明化試劑盒可以高效地進行脫色脫脂，采用親水性溫和環(huán)境的設(shè)計，在組織熒光保護、樣本形態(tài)維持、降低自發(fā)熒光等方面表現(xiàn)出比較優(yōu)異的性能，適用范圍廣、操作簡便、速度快、效率高。