細胞遷移在許多復(fù)雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：當在匯合細胞單層上產(chǎn)生人工時，所產(chǎn)生的間隙邊緣上的細胞將遷移直至建立新的細胞。ibidi Culture-Insert系列為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟。

 

 

本應(yīng)用介紹是使用ibidiCulture-Insert 2 Well分析MCF-7細胞遷移行為的詳細方案。

圖1.使用ibidi Culture-Insert 2 Well進行傷口愈合測定的實驗工作流程

ibidi Culture-Insert 2Well放置在細胞培養(yǎng)皿表面上，提供兩個細胞培養(yǎng)容器，每個容室由500μm壁隔開。在兩個儲庫中填充細胞懸浮液僅允許細胞在指定區(qū)域生長。細胞附著后移除2孔培養(yǎng)插件，產(chǎn)生大約500μm的無細胞間隙。顯微鏡用于評估傷口愈合過程。根據(jù)您感興趣的焦點，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點觀察圖像來完成。測量細胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細胞遷移特征。

實驗工作流程也可以應(yīng)用于Culture-Insert 3 Well和Culture-Insert 4 Well。唯一的區(qū)別是更多的孔和相應(yīng)的更多的無細胞劃痕。

Culture-Insert 3 Well和Culture-Insert 4 Well

1.  材料

• 細胞：                              MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ:ACC115)

• 培養(yǎng)耗材:                  2孔插件放在35毫米的培養(yǎng)皿中，高壁（ibidi，                                                      80206）

• 細胞培養(yǎng)表面：                   ibidi ibitreat

• 細胞培養(yǎng)基：                    RPMI (西格瑪,R8758) = 10% FCS (西格瑪,  F0804)

• 細胞解離溶液：                 胰蛋白酶-ETDA（Sigma，59418C）

• 無菌鑷子

• 倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細胞成像的鏡載培養(yǎng)箱

 

2.實驗工作流程

步驟1：細胞接種

為了建立可靠的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，您必須在開始實驗之前定義實驗參數(shù)。這包括例如選擇正確的細胞接種密度。我們建議使用24小時后產(chǎn)生100％光學匯合細胞層的密度。

1. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將細胞懸液調(diào)節(jié)至合適細胞濃度。在24小時后獲得3×105細胞/ ml以獲得匯合的細胞層。

2. 將70μl細胞懸浮液應(yīng)用于Culture-Insert2孔的每個孔中。避免搖動μ-Dish，因為這會導(dǎo)致細胞分布不均勻。

3.將細胞在37°C和5％CO2下孵育至少24小時

圖2在ibidi Culture-Insert 2 Well中接種細胞

第2步：間隙形成

匯合細胞層是開始該測定的先決條件。去除Culture-Insert 2孔插件后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要，補充培養(yǎng)基中的抑制或增強物質(zhì)，以評估其對細胞遷移行為的影響。

1.  在顯微鏡下24小時后檢查細胞密度。如果在24小時后沒有達到匯合的細胞層，則將μ-Dish再次置于細胞培養(yǎng)箱中12-24小時，定期檢查匯合點。

2.用無菌鑷子輕輕取出Culture-Insert 2孔。如圖3所示，從插件的一角移除

圖3使用無菌鑷子去除ibidi Culture-Insert 2孔
 

3  . 移除插入后，檢查您的細胞層是否仍附著在μ-Dish的表面上。

4.  用無細胞培養(yǎng)基或PBS清洗細胞層，去除細胞碎片和非附著細胞。

5.使用推薦體積為2 ml的無細胞培養(yǎng)基填充μ-Dish

圖4由ibidi Culture-Insert 2 Well創(chuàng)建的無細胞劃痕
 

3步：獲取顯微圖像

我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。

1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動它直到你有間隙，并在圖像中捕獲兩個細胞前端。使用4x / 5x或10x物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

2. 在接下來的幾個小時內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程。

3. 在ibiTreat表面上培養(yǎng)的MCF-7細胞的時間推移測量進行20小時，時間間隔為30分鐘。

圖5使用MCF-7細胞的遷移測定的不同時間測量（比例尺：200μm）
 

步驟4：使用ACAS和數(shù)據(jù)解釋進行定量圖像分析

 

必須分析顯微照片以獲得關(guān)于培養(yǎng)細胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以使用自動圖像分析完成自動細胞分析系統(tǒng)（ACAS）由ibidi提供。

使用ACAS分析此處顯示的示例數(shù)據(jù)。自動圖像分析檢測細胞覆蓋區(qū)域。相對于時間繪制細胞覆蓋區(qū)域顯示了間隙閉合的過程。線性相可用于表征遷移（=傷口閉合的速度）。

線性相的斜率顯示平均刮擦閉合速度為0.0184×106μm2/小時（= 0.44×106μm2/天）。

 

圖6 ACAS傷口愈合實驗的定量圖像分析

 

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