1. 收到細胞（貨號：CTCC-ACL-0131）后，75%酒精消毒，置于細胞培養(yǎng)箱中靜置2-3h，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)；

2. 觀察細胞生長情況，細胞密度低于80%時，貼壁細胞倒去瓶中培養(yǎng)液，留下8ml作用繼續(xù)培養(yǎng)；細胞密度大于80%時，即可進行傳代；

3. 培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)液收集，留3ml左右，輕輕拍打瓶底，用吸管吹打，將細胞吹打成細胞懸液（無需用胰蛋白酶消化）或者用細胞刮板輕輕刮下來；

4. 收集細胞懸液至離心管內，1000rpm離心5min，觀察細胞沉淀；

6.加入1ml的完全培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細胞懸液，均勻分配至細胞培養(yǎng)瓶中，初次傳代建議按照1：2比例進行。

RAW264.7細胞株誘導處理

誘導操作及注意事項

1. 使用37℃預熱的破骨誘導分化培養(yǎng)基（貨號：CCTCC-Y005）重懸細胞，按照5000~20000 cells/cm2密度進行鋪板，48孔板培養(yǎng)基體積建議400-500μL。

2.細胞每隔1d全量換液一次，每次換液前破骨誘導分化培養(yǎng)基應37℃預熱

3. 誘導分化4-10天，可觀察到成熟的多核破骨細胞。

注意事項：以下情況都會造成破骨誘導不成功或者破骨分化效率低

（1）RAW264.7細胞分化程度過高，即未誘導時伸出偽足的細胞比例過高

（2）接種密度不恰當

（3）長時間在培養(yǎng)箱外觀察

（4）實驗時誘導分化培養(yǎng)基未預熱

（5）誘導分化培養(yǎng)基保存失當，反復溫浴和冷藏交替
 

誘導中細胞狀態(tài)

 

誘導中細胞狀態(tài)
 

細胞樣本(以 48 孔板為例)：

1. 移除細胞培養(yǎng)液，每孔加入 400μL 1 號洗滌液（貨號:CTCC-JD005）清洗，棄液；

2. 每孔加入 300μL 固定液，室溫固定 15-30min，棄液；

3. 每孔加入 300μL 2 號洗滌液，清洗 2 次；

4. 染色：每孔加入 150-200μL TRAP 染色液，37℃避光孵育 10-15min(待測樣品中酒石酸酸性磷酸酶活性較低時，可適當延長孵育時間至 30 分鐘或顯微鏡下顯色至預期深淺)。

5.每孔加入 300μL 2 號洗滌液，清洗 2 次；

6.顯微鏡下觀察和拍照；

7.每孔加入 300μL 保存液，4℃放置，可保存一周。
 

客戶常見問題解答

1、為什么有的人誘導4天就成破骨了而我需要7天甚至更久呢？

答：誘導周期是動態(tài)的過程，要結合誘導過程中細胞狀態(tài)來。看前期是否出現過破骨又碎掉，如果是碎過一輪了，那就沒必要誘導了。如果至整個誘導周期中首次出現破骨，且細胞整體匯合度還比較低的情況，還是可以持續(xù)誘導的。

2、我誘導成功了什么時候進行染色最適合呢？

答：誘導成功后立即進行染色，破骨成熟期只有24小時 24小時后破骨會破碎。

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菩禾生物簡介
 

無錫菩禾生物技術有限公司(簡稱“菩禾”)成立于2013年，位于無錫國家生物產業(yè)基地---百橋生物科技園，是一家集成細胞生產、應用的高新技術企業(yè)專注于為藥企、各類科研機構及CRO企業(yè)提供符合標準規(guī)范的細胞資源、細胞培養(yǎng)基、細胞檢測試劑盒和細胞培養(yǎng)設備。公司還建有完善的細胞建系、細胞篩選、細胞建庫、細胞檢測等技術服務體系。目前建有的技術平臺有細胞生物學測試平臺、原代細胞分離平臺、動物實驗平臺、免疫學平臺及分子生物學平臺。