使用Megazyme試劑盒對(duì)支鏈淀粉和直鏈淀粉進(jìn)行測(cè)定
簡(jiǎn)介：
谷物淀粉的許多特性決定了它們是否適合特定的最終用途，取決于它們的直鏈淀粉/支鏈淀粉比率。這些特性包括凝膠化和凝膠化特性、溶解性、抗性淀粉的形成，以及大米的烹飪和全谷類的質(zhì)地特征。因此，淀粉直鏈淀粉含量的測(cè)定是淀粉加工的重要質(zhì)量指標(biāo)。1-5
谷物淀粉中的直鏈淀粉最常見的測(cè)定方法是電位法、安培法或比色法測(cè)定直鏈淀粉的碘結(jié)合能力，并由此形成直鏈淀粉-碘包合物。然而，這些方法存在不確定性。支鏈淀粉-碘絡(luò)合物也會(huì)形成，這些會(huì)降低用非比色法測(cè)得的游離碘濃度，并可能以與比色法中的直鏈淀粉-碘絡(luò)合物在類似波長(zhǎng)下吸收。這些復(fù)合物導(dǎo)致對(duì)直鏈淀粉的高估，需要進(jìn)行修正。Gibson等人詳細(xì)介紹了在使用這些方法時(shí)遇到的許多其他問題。6-1011
支鏈淀粉與凝集素刀豆蛋白A（cona）的特殊形成為淀粉中直鏈淀粉的測(cè)定提供了一種不受這些不確定性影響的替代方法。在一定的pH、溫度和離子強(qiáng)度條件下，cona以α-D-吡喃葡萄糖或α-D-甘露聚糖為基元，在多個(gè)非還原性端基上與多個(gè)支鏈多糖形成沉淀。因此，cona有效地復(fù)合了淀粉的支鏈淀粉組分，而不是主要的直鏈淀粉組分。12-13
本手冊(cè)中描述的程序是對(duì)Yun和Matheson（1990）開發(fā)的CONA方法的修改。它在分析前使用乙醇預(yù)處理步驟去除脂質(zhì)[修改自Morrison和Laignelet（1983）]。13137
原則：
淀粉樣品在二甲基亞砜（DMSO）中加熱完全分散。通過在乙醇中沉淀淀粉并回收沉淀的淀粉來去除脂質(zhì)。在醋酸鹽/鹽溶液中溶解沉淀樣品后，通過添加cona使支鏈淀粉沉淀，并通過離心分離除去支鏈淀粉。上清液中的一小份直鏈淀粉被酶水解成D-葡萄糖，并使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑對(duì)其進(jìn)行分析�？偟矸�，在一份單獨(dú)的醋酸鹽/鹽溶液中，同樣地水解為D-葡萄糖，并通過葡萄糖氧化酶/過氧化物酶進(jìn)行色度測(cè)量。淀粉樣品中的直鏈淀粉濃度估計(jì)為cona沉淀樣品上清液510nm處的GOPOD吸光度與總淀粉樣品上清液吸光度的比值。
本程序適用于所有純淀粉樣品和谷類面粉。
準(zhǔn)確度：
對(duì)一組樣品的重復(fù)分析產(chǎn)生了重復(fù)性（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)），純淀粉的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，谷類粉的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為~10%。
套件：
Megazyme提供適合執(zhí)行100次分析的試劑盒。
試劑盒包含完整的分析方法以及：
試劑溶液/懸浮液的制備：
1. 將1號(hào)瓶的內(nèi)容物溶解在50毫升CONA溶劑（緩沖液3，第4頁(yè)）中。分為適當(dāng)大小的小份，并在使用之間儲(chǔ)存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用過程中保持冷卻。在-10℃以下穩(wěn)定2年以上。
2. 將瓶2的內(nèi)容物溶解在20 mL醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）中。分為適當(dāng)大小的等分試樣，并在使用期間儲(chǔ)存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用過程中保持冷卻。在-10℃以下穩(wěn)定2年以上。
3. 將瓶3（GOPOD試劑緩沖液）的內(nèi)容物稀釋至此溶液（1）為蒸餾水。立即使用。
注：
1. 儲(chǔ)存時(shí)，鹽晶體可能在濃縮緩沖液中形成。當(dāng)用蒸餾水將緩沖液稀釋至1L時(shí)，必須將其完全溶解。
2. 該緩沖液含有0.095%（w/v）疊氮化鈉。
這是一種有毒的化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)該進(jìn)行相應(yīng)的處理。
4. 用20毫升溶液3溶解4號(hào)瓶的內(nèi)容物，并將其定量轉(zhuǎn)移到含有剩余溶液3的瓶子中。用鋁箔蓋住這個(gè)瓶子，以保護(hù)密封的試劑不受光照。這是葡萄糖測(cè)定試劑（GOPOD試劑）。在2-5°C或低于-10°C下存放超過12個(gè)月，可穩(wěn)定~3個(gè)月。
5號(hào)和6號(hào)。使用提供的瓶子5和6的內(nèi)容物。
室溫下可穩(wěn)定5年以上。
緩沖液和溶劑（未提供）：
1 乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）
向900 mL蒸餾水中添加5.9 mL冰醋酸（1.05 g/mL）。通過添加1 M（4 g/100 mL）氫氧化鈉溶液（需要大約30 mL），將pH值調(diào)節(jié)至pH 4.5。加入0.2g疊氮化鈉，調(diào)節(jié)體積至1L，室溫下穩(wěn)定2年以上。
2 濃縮ConA溶劑（600 mM，pH 6.4醋酸鈉緩沖液）
溶解49.2 g無水乙酸鈉（Sigma cat。不。
71183），175.5 g氯化鈉（Sigma cat。編號(hào)：S7653），
0.5 g CaCl.2HO（Sigma cat。編號(hào)C5080），0.7 g MgCl.6HO（Sigma cat。編號(hào)M2670）和0.7 g MnCl.4HO（Sigma cat。在900毫升蒸餾水中。逐滴加入冰醋酸，調(diào)節(jié)pH至6.4，然后用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1L。在4℃下穩(wěn)定2周。222222
注：制備此緩沖混合物時(shí)，必須非常小心地調(diào)整pH值。如果pH值顯著低于6.4，則會(huì)形成沉淀，并且在pH值調(diào)整時(shí)不會(huì)重新溶解。因此，必須丟棄該緩沖液并制備新的一批。
三。CONA溶劑（工作濃度）
用蒸餾水將30ml濃縮cona溶劑稀釋至100ml。準(zhǔn)備當(dāng)天使用。
4 二甲基亞砜
分析試劑等級(jí)（BDH Analar cat。編號(hào)10323）。室溫下穩(wěn)定5年。
設(shè)備（推薦）：
1. 玻璃器皿：
- 容量瓶（25ml）；
- 玻璃試管（16 x 120毫米，15毫升）；
- 螺旋蓋樣品管（Kimax）（10 mL）。®
2. 微量移液器，用于分配50-1000µL（例如Gilson Piptman）。
3. 容積式移液器，如Eppendorf Multipette。®
4. Eppendorf微型膠管（容量2.0 mL）。®
5. 開水浴。
6. 臺(tái)式離心機(jī)（容量2000g）。
7. 渦流混合器（如IKA Yellowline試管振蕩器TTS2）。®
8. 分光光度計(jì)（設(shè)置為510 nm）。
9. 停車鐘。
10. 分析天平。
11. 微型食品（容量14000克）。
12. 恒溫水浴器設(shè)置為40°C。
注意事項(xiàng)：
淀粉樣品必須按照說明用乙醇預(yù)處理，以去除脂質(zhì)。如果樣品不經(jīng)乙醇處理，一些樣品中的直鏈淀粉含量可能會(huì)低估50%。
化驗(yàn)程序：
A、 淀粉預(yù)處理
1. 準(zhǔn)確稱取淀粉或面粉樣品（20-25毫克精確到0.1毫克）到一個(gè)10毫升螺旋蓋的Kimax樣品管中。記錄樣品重量，精確至0.1 mg。®
注：每批包括一個(gè)參考樣品。每五個(gè)試樣重復(fù)一次。
2. 向試管中加入1ml二甲基亞砜，同時(shí)在渦流混合器上以低速輕輕攪拌。蓋住試管，在沸水浴中加熱試管內(nèi)容物，直到樣品完全分散（大約1分鐘）。確保沒有凝膠狀的淀粉塊殘留。
3. 在渦流混合器上高速?gòu)?qiáng)力混合密封管的內(nèi)容物，將管放入沸水浴中加熱15分鐘，在渦流混合器上間歇高速攪拌。
4. 將試管在室溫下儲(chǔ)存約5分鐘，并在渦流混合器上連續(xù)攪拌，添加2ml 95%（v/v）乙醇。再加4毫升乙醇，蓋上試管，倒置攪拌。會(huì)形成淀粉沉淀物。讓試管靜置15分鐘（或過夜，如果需要）。
5. 離心試管（2000 g）5分鐘，丟棄上清液，并將試管放在紙巾上10分鐘。確保已排出所有乙醇。在隨后的直鏈淀粉和淀粉測(cè)定中使用顆粒。
6. 向淀粉顆粒中添加2ml二甲基亞砜（用溫和的渦流混合）。將試管放在沸水浴中15分鐘，偶爾攪拌。確保沒有膠狀腫塊。
7. 從沸水浴中取出試管后，立即添加4 mL Con A溶劑（緩沖液3；第4頁(yè)），充分混合，然后定量轉(zhuǎn)移試管內(nèi)容物（用Con A溶劑反復(fù)洗滌）至25 mL容量瓶中。用CONA溶劑（這是溶液A）稀釋至一定體積。如有必要，用Whatman 1號(hào)濾紙過濾此溶液（整個(gè)面粉樣品需要此步驟）。®
注：該溶液應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。
B、 支鏈淀粉的沉淀與直鏈淀粉的測(cè)定
1. 將1.0 mL溶液A轉(zhuǎn)移到2.0 mL Eppendorf microfuge試管中。添加0.50 mL CONA溶液（瓶1），蓋上試管并通過反復(fù)倒置輕輕混合。避免樣品起泡。®
2. 讓試管在室溫下靜置1小時(shí)。在室溫下，將14000 g在微型食品中離心10分鐘。
注：
1. 不能將CONA溶劑（即上文A節(jié)所述的溶液A）中的樣品放置較長(zhǎng)時(shí)間，因?yàn)橹辨湹矸蹠?huì)傾向于逆行和沉淀。
2. 在室溫下，支鏈淀粉的有效cona沉淀（以上步驟B1）所需的時(shí)間為1h。
然而，這些溶液不應(yīng)超過2小時(shí)，因?yàn)橹辨湹矸蹖②呌谀嫘小?br /> 3. 在這個(gè)過程中，用乙醇對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理有一個(gè)額外的優(yōu)點(diǎn)，即去除樣品中可能干擾測(cè)定的任何可溶性糖。
3. 將1ml上清液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中。添加3 mL 100 mM乙酸鈉緩沖液，pH值4.5。這會(huì)使pH值降至~5。混合所有成分，輕輕塞上塞子（用大理石），在沸水浴中加熱5分鐘，使cona變性。
4. 將試管置于40°C的水浴中，使其平衡5分鐘。添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶混合物（第3頁(yè)；溶液2），并在40°C下培養(yǎng)30分鐘。在2000 g下離心試管5分鐘。
5. 向1.0 mL上清液的等分試樣中添加4 mL GOPOD
試劑（試劑B）。在40°C下培養(yǎng)20分鐘。同時(shí)培養(yǎng)試劑空白和D-葡萄糖對(duì)照品。
注：
通過將1.0 mL 100 mM醋酸鈉緩沖液（緩沖液1；第4頁(yè)）添加到4.0 mL GOPOD試劑中，并在40℃下培養(yǎng)20 min來制備試劑空白。
D-葡萄糖控制（副本）包括0.1 mL D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）、0.9 mL醋酸鈉緩沖液和4.0 mL GOPOD試劑。計(jì)算中不使用該值，但我們建議執(zhí)行該值以確保該部分分析沒有問題。
6.在510 nm處，對(duì)照試劑空白，讀取每個(gè)樣品和D-葡萄糖對(duì)照品的吸光度。
C、 總淀粉的測(cè)定
1. 將0.5 mL溶液A與4 mL 100 mM乙酸鈉緩沖液（pH值4.5）混合。
2. 添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶溶液，并在40°C下培養(yǎng)10分鐘。
3. 移取1.0 mL等分試樣（一式兩份）于玻璃試管中，加入4 mL GOPOD試劑（溶液4），混勻。在40°C下培養(yǎng)20分鐘。該培養(yǎng)應(yīng)與上述B節(jié)中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行。
谷物淀粉的許多特性決定了它們是否適合特定的最終用途，取決于它們的直鏈淀粉/支鏈淀粉比率。這些特性包括凝膠化和凝膠化特性、溶解性、抗性淀粉的形成，以及大米的烹飪和全谷類的質(zhì)地特征。因此，淀粉直鏈淀粉含量的測(cè)定是淀粉加工的重要質(zhì)量指標(biāo)。1-5
谷物淀粉中的直鏈淀粉最常見的測(cè)定方法是電位法、安培法或比色法測(cè)定直鏈淀粉的碘結(jié)合能力，并由此形成直鏈淀粉-碘包合物。然而，這些方法存在不確定性。支鏈淀粉-碘絡(luò)合物也會(huì)形成，這些會(huì)降低用非比色法測(cè)得的游離碘濃度，并可能以與比色法中的直鏈淀粉-碘絡(luò)合物在類似波長(zhǎng)下吸收。這些復(fù)合物導(dǎo)致對(duì)直鏈淀粉的高估，需要進(jìn)行修正。Gibson等人詳細(xì)介紹了在使用這些方法時(shí)遇到的許多其他問題。6-1011
支鏈淀粉與凝集素刀豆蛋白A（cona）的特殊形成為淀粉中直鏈淀粉的測(cè)定提供了一種不受這些不確定性影響的替代方法。在一定的pH、溫度和離子強(qiáng)度條件下，cona以α-D-吡喃葡萄糖或α-D-甘露聚糖為基元，在多個(gè)非還原性端基上與多個(gè)支鏈多糖形成沉淀。因此，cona有效地復(fù)合了淀粉的支鏈淀粉組分，而不是主要的直鏈淀粉組分。12-13
本手冊(cè)中描述的程序是對(duì)Yun和Matheson（1990）開發(fā)的CONA方法的修改。它在分析前使用乙醇預(yù)處理步驟去除脂質(zhì)[修改自Morrison和Laignelet（1983）]。13137
原則：
淀粉樣品在二甲基亞砜（DMSO）中加熱完全分散。通過在乙醇中沉淀淀粉并回收沉淀的淀粉來去除脂質(zhì)。在醋酸鹽/鹽溶液中溶解沉淀樣品后，通過添加cona使支鏈淀粉沉淀，并通過離心分離除去支鏈淀粉。上清液中的一小份直鏈淀粉被酶水解成D-葡萄糖，并使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑對(duì)其進(jìn)行分析�？偟矸�，在一份單獨(dú)的醋酸鹽/鹽溶液中，同樣地水解為D-葡萄糖，并通過葡萄糖氧化酶/過氧化物酶進(jìn)行色度測(cè)量。淀粉樣品中的直鏈淀粉濃度估計(jì)為cona沉淀樣品上清液510nm處的GOPOD吸光度與總淀粉樣品上清液吸光度的比值。
本程序適用于所有純淀粉樣品和谷類面粉。
準(zhǔn)確度：
對(duì)一組樣品的重復(fù)分析產(chǎn)生了重復(fù)性（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)），純淀粉的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，谷類粉的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為~10%。
套件：
Megazyme提供適合執(zhí)行100次分析的試劑盒。
試劑盒包含完整的分析方法以及：
| 瓶子1： | 凍干cona。 |
| 在-10℃以下穩(wěn)定5年以上。 | |
| 瓶子2： | 淀粉葡萄糖苷酶[200 U對(duì)硝基苯基 |
| β-麥芽糖苷（即在pH值為4.5的條件下，淀粉上的β-麥芽糖苷為3300 U | |
| 40°C）]加真菌α-淀粉酶（Ceralpha 500 U） | |
| pH值為5.0和40°C的試劑），2 mL。 | |
| 在4°C下穩(wěn)定>5年。 | |
| 瓶子3： | GOPOD試劑緩沖液。緩沖液（50 mL， |
| pH7.4），對(duì)羥基苯甲酸和疊氮化鈉 | |
| （0.095%w/v）。 | |
| 在4°C下穩(wěn)定>4年。 | |
| 瓶子4： | GOPOD試劑酶。葡萄糖氧化酶 |
| 加上過氧化物酶和4-氨基安替比林。凍結(jié)- | |
| 干粉。 | |
| 在-10℃以下穩(wěn)定5年以上。 | |
| 瓶子5： | D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL，1.0 mg/mL）在 |
| 0.2%（w/v）苯甲酸。 | |
| 室溫下可穩(wěn)定5年以上。 | |
| 瓶子6： | 淀粉對(duì)照品（規(guī)定含量 |
| 直鏈淀粉）。 | |
| 室溫下可穩(wěn)定5年以上。 |
試劑溶液/懸浮液的制備：
1. 將1號(hào)瓶的內(nèi)容物溶解在50毫升CONA溶劑（緩沖液3，第4頁(yè)）中。分為適當(dāng)大小的小份，并在使用之間儲(chǔ)存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用過程中保持冷卻。在-10℃以下穩(wěn)定2年以上。
2. 將瓶2的內(nèi)容物溶解在20 mL醋酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）中。分為適當(dāng)大小的等分試樣，并在使用期間儲(chǔ)存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用過程中保持冷卻。在-10℃以下穩(wěn)定2年以上。
3. 將瓶3（GOPOD試劑緩沖液）的內(nèi)容物稀釋至此溶液（1）為蒸餾水。立即使用。
注：
1. 儲(chǔ)存時(shí)，鹽晶體可能在濃縮緩沖液中形成。當(dāng)用蒸餾水將緩沖液稀釋至1L時(shí)，必須將其完全溶解。
2. 該緩沖液含有0.095%（w/v）疊氮化鈉。
這是一種有毒的化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)該進(jìn)行相應(yīng)的處理。
4. 用20毫升溶液3溶解4號(hào)瓶的內(nèi)容物，并將其定量轉(zhuǎn)移到含有剩余溶液3的瓶子中。用鋁箔蓋住這個(gè)瓶子，以保護(hù)密封的試劑不受光照。這是葡萄糖測(cè)定試劑（GOPOD試劑）。在2-5°C或低于-10°C下存放超過12個(gè)月，可穩(wěn)定~3個(gè)月。
5號(hào)和6號(hào)。使用提供的瓶子5和6的內(nèi)容物。
室溫下可穩(wěn)定5年以上。
| 安全注意事項(xiàng)： 1. 二甲基亞砜（DMSO）被列入默克指數(shù)（No。 3255）作為皮膚刺激物，因此應(yīng)謹(jǐn)慎使用。它通過皮膚吸收，會(huì)對(duì)皮膚和眼睛造成刺激。穿戴PPE，避免溶劑飛濺。盡可能在通風(fēng)櫥中使用。 2. 刀豆蛋白A通過吸入、皮膚接觸和攝入有害。影響可能是不可逆的，可能涉及致畸。處理結(jié)晶CONA時(shí)穿戴適當(dāng)?shù)腜PE，處理含有CONA的溶液時(shí)戴手套。 3. 疊氮化鈉是一種有毒化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)處理。它只是作為防腐劑添加到緩沖液中的�？梢詮木彌_配方中刪除，但緩沖液應(yīng)儲(chǔ)存在4°C。 |
緩沖液和溶劑（未提供）：
1 乙酸鈉緩沖液（100 mM，pH 4.5）
向900 mL蒸餾水中添加5.9 mL冰醋酸（1.05 g/mL）。通過添加1 M（4 g/100 mL）氫氧化鈉溶液（需要大約30 mL），將pH值調(diào)節(jié)至pH 4.5。加入0.2g疊氮化鈉，調(diào)節(jié)體積至1L，室溫下穩(wěn)定2年以上。
2 濃縮ConA溶劑（600 mM，pH 6.4醋酸鈉緩沖液）
溶解49.2 g無水乙酸鈉（Sigma cat。不。
71183），175.5 g氯化鈉（Sigma cat。編號(hào)：S7653），
0.5 g CaCl.2HO（Sigma cat。編號(hào)C5080），0.7 g MgCl.6HO（Sigma cat。編號(hào)M2670）和0.7 g MnCl.4HO（Sigma cat。在900毫升蒸餾水中。逐滴加入冰醋酸，調(diào)節(jié)pH至6.4，然后用蒸餾水將體積調(diào)節(jié)至1L。在4℃下穩(wěn)定2周。222222
注：制備此緩沖混合物時(shí)，必須非常小心地調(diào)整pH值。如果pH值顯著低于6.4，則會(huì)形成沉淀，并且在pH值調(diào)整時(shí)不會(huì)重新溶解。因此，必須丟棄該緩沖液并制備新的一批。
三。CONA溶劑（工作濃度）
用蒸餾水將30ml濃縮cona溶劑稀釋至100ml。準(zhǔn)備當(dāng)天使用。
4 二甲基亞砜
分析試劑等級(jí)（BDH Analar cat。編號(hào)10323）。室溫下穩(wěn)定5年。
設(shè)備（推薦）：
1. 玻璃器皿：
- 容量瓶（25ml）；
- 玻璃試管（16 x 120毫米，15毫升）；
- 螺旋蓋樣品管（Kimax）（10 mL）。®
2. 微量移液器，用于分配50-1000µL（例如Gilson Piptman）。
3. 容積式移液器，如Eppendorf Multipette。®
4. Eppendorf微型膠管（容量2.0 mL）。®
5. 開水浴。
6. 臺(tái)式離心機(jī)（容量2000g）。
7. 渦流混合器（如IKA Yellowline試管振蕩器TTS2）。®
8. 分光光度計(jì)（設(shè)置為510 nm）。
9. 停車鐘。
10. 分析天平。
11. 微型食品（容量14000克）。
12. 恒溫水浴器設(shè)置為40°C。
注意事項(xiàng)：
淀粉樣品必須按照說明用乙醇預(yù)處理，以去除脂質(zhì)。如果樣品不經(jīng)乙醇處理，一些樣品中的直鏈淀粉含量可能會(huì)低估50%。
化驗(yàn)程序：
A、 淀粉預(yù)處理
1. 準(zhǔn)確稱取淀粉或面粉樣品（20-25毫克精確到0.1毫克）到一個(gè)10毫升螺旋蓋的Kimax樣品管中。記錄樣品重量，精確至0.1 mg。®
注：每批包括一個(gè)參考樣品。每五個(gè)試樣重復(fù)一次。
2. 向試管中加入1ml二甲基亞砜，同時(shí)在渦流混合器上以低速輕輕攪拌。蓋住試管，在沸水浴中加熱試管內(nèi)容物，直到樣品完全分散（大約1分鐘）。確保沒有凝膠狀的淀粉塊殘留。
3. 在渦流混合器上高速?gòu)?qiáng)力混合密封管的內(nèi)容物，將管放入沸水浴中加熱15分鐘，在渦流混合器上間歇高速攪拌。
4. 將試管在室溫下儲(chǔ)存約5分鐘，并在渦流混合器上連續(xù)攪拌，添加2ml 95%（v/v）乙醇。再加4毫升乙醇，蓋上試管，倒置攪拌。會(huì)形成淀粉沉淀物。讓試管靜置15分鐘（或過夜，如果需要）。
5. 離心試管（2000 g）5分鐘，丟棄上清液，并將試管放在紙巾上10分鐘。確保已排出所有乙醇。在隨后的直鏈淀粉和淀粉測(cè)定中使用顆粒。
6. 向淀粉顆粒中添加2ml二甲基亞砜（用溫和的渦流混合）。將試管放在沸水浴中15分鐘，偶爾攪拌。確保沒有膠狀腫塊。
7. 從沸水浴中取出試管后，立即添加4 mL Con A溶劑（緩沖液3；第4頁(yè)），充分混合，然后定量轉(zhuǎn)移試管內(nèi)容物（用Con A溶劑反復(fù)洗滌）至25 mL容量瓶中。用CONA溶劑（這是溶液A）稀釋至一定體積。如有必要，用Whatman 1號(hào)濾紙過濾此溶液（整個(gè)面粉樣品需要此步驟）。®
注：該溶液應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。
B、 支鏈淀粉的沉淀與直鏈淀粉的測(cè)定
1. 將1.0 mL溶液A轉(zhuǎn)移到2.0 mL Eppendorf microfuge試管中。添加0.50 mL CONA溶液（瓶1），蓋上試管并通過反復(fù)倒置輕輕混合。避免樣品起泡。®
2. 讓試管在室溫下靜置1小時(shí)。在室溫下，將14000 g在微型食品中離心10分鐘。
注：
1. 不能將CONA溶劑（即上文A節(jié)所述的溶液A）中的樣品放置較長(zhǎng)時(shí)間，因?yàn)橹辨湹矸蹠?huì)傾向于逆行和沉淀。
2. 在室溫下，支鏈淀粉的有效cona沉淀（以上步驟B1）所需的時(shí)間為1h。
然而，這些溶液不應(yīng)超過2小時(shí)，因?yàn)橹辨湹矸蹖②呌谀嫘小?br /> 3. 在這個(gè)過程中，用乙醇對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理有一個(gè)額外的優(yōu)點(diǎn)，即去除樣品中可能干擾測(cè)定的任何可溶性糖。
3. 將1ml上清液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中。添加3 mL 100 mM乙酸鈉緩沖液，pH值4.5。這會(huì)使pH值降至~5。混合所有成分，輕輕塞上塞子（用大理石），在沸水浴中加熱5分鐘，使cona變性。
4. 將試管置于40°C的水浴中，使其平衡5分鐘。添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶混合物（第3頁(yè)；溶液2），并在40°C下培養(yǎng)30分鐘。在2000 g下離心試管5分鐘。
5. 向1.0 mL上清液的等分試樣中添加4 mL GOPOD
試劑（試劑B）。在40°C下培養(yǎng)20分鐘。同時(shí)培養(yǎng)試劑空白和D-葡萄糖對(duì)照品。
注：
通過將1.0 mL 100 mM醋酸鈉緩沖液（緩沖液1；第4頁(yè)）添加到4.0 mL GOPOD試劑中，并在40℃下培養(yǎng)20 min來制備試劑空白。
D-葡萄糖控制（副本）包括0.1 mL D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）、0.9 mL醋酸鈉緩沖液和4.0 mL GOPOD試劑。計(jì)算中不使用該值，但我們建議執(zhí)行該值以確保該部分分析沒有問題。
6.在510 nm處，對(duì)照試劑空白，讀取每個(gè)樣品和D-葡萄糖對(duì)照品的吸光度。
C、 總淀粉的測(cè)定
1. 將0.5 mL溶液A與4 mL 100 mM乙酸鈉緩沖液（pH值4.5）混合。
2. 添加0.1 mL淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶溶液，并在40°C下培養(yǎng)10分鐘。
3. 移取1.0 mL等分試樣（一式兩份）于玻璃試管中，加入4 mL GOPOD試劑（溶液4），混勻。在40°C下培養(yǎng)20分鐘。該培養(yǎng)應(yīng)與上述B節(jié)中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行。
標(biāo)簽：
直鏈淀粉/支鏈淀粉測(cè)定說明
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com