在過去30年間，高效液相色譜法（HPLC）已經(jīng)成為世界各地實驗室應用最廣泛的技術(shù)之一。這是因為HPLC是一種強大的多用途技術(shù)。它的強大體現(xiàn)在其應用范圍廣泛，覆蓋從毛細管級到制備級的各個范圍；在相關(guān)的檢測技術(shù)范圍內(nèi)，它是一種多用途技術(shù)，能檢測多種化合物。從根本上說，目前，HPLC技術(shù)的發(fā)展方向主要有三個方面：化學、檢測器和系統(tǒng)／數(shù)據(jù)管理。色譜法在這些方面的進展使該技術(shù)得到了廣泛認可。盡管如此，色譜技術(shù)仍有進一步發(fā)展的空間。那么，HPLC的未來將是怎樣一幅圖景？后續(xù)有哪些發(fā)展成果能擴大和延展這種公認技術(shù)的功用？

UPLCTM的定義
液相色譜法的前沿技術(shù)正在研發(fā)中。北加利福尼亞大學的J. Jorgensen博士和楊百翰大學的M. Lee博士最近都發(fā)表了關(guān)于色譜實驗室未來分析范圍的深刻見解。他們的研究為分離科學描繪了一幅新圖景。通過使用比以前小得多顆粒，使分離過程達到了一個新的終點。該方法的基本原理體現(xiàn)在范第姆特方程中。范第姆特方程是一個描述線速度與塔板高度（柱效）關(guān)系的經(jīng)驗式。
 
鑒于顆粒大小是變量之一，因此，它可用來描述各種顆粒大小的理論性能（圖1）。從圖1可以看出，一旦填料的顆粒大小低于2 μm，色譜技術(shù)就能達到一個新水平：不僅柱效更高，而且隨著流速的提高不會使柱效降低。

 
圖1：這些范第姆特曲線表明過去30年間顆粒大小的減小過程。理論塔板高度的降低意味著效率的提高。但即使是2.5 μm的顆粒，其效率也會在較高的流速下開始下降，而系統(tǒng)反壓則會相應增高。如果使用UPLCTM技術(shù)和2 μm以下的顆粒，那么即使在較高的線速度下，效率也能得以保持。更短色譜柱和／或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和靈敏度，從而使現(xiàn)在有可能充分利用色譜原理進行分離。
 
這就呈現(xiàn)了這樣一種情景：峰容量和分離速度均被提高至新的極限。簡言之，峰容量被定義為色譜法每單位時間內(nèi)所能分辨的峰數(shù)量。峰容量和分離速度等性能指標得到提高后的色譜法被稱為超高效液相色譜法，或UPLCTM。圖2說明了當顆粒大小從5 μm減小至1.7 μm時，增加的峰容量對色譜分離性能的影響。
 

圖2：比較5 μm顆粒與1.7 μm顆粒。峰容量和分辨率顯著增加。

速度、靈敏度和分辨率
源于更小顆粒的額外效率可帶來更多的明顯益處。更短的色譜柱或更高的流速加快了速度，同時小顆粒也提高了分辨率。對于任何給定的分離，都可通過調(diào)節(jié)這些變量而達到速度和分辨率的最佳組合。圖3顯示了UPLC與HPLC的速度比較結(jié)果。該實驗比較了相同分辨率下，3 μm顆粒和1.7 μm顆粒的分離速度；結(jié)果表明較小顆粒的分離速度更快。效率的提高還帶來了進一步的益處：靈敏度提高。由于分離過程中的區(qū)帶變窄，因此分析物會更集中在檢測點上。當考慮UPLC的儀器設計要求時，將對這一點進行更詳細的論述。

應該指出的是：3 μm是15 cm長普通色譜柱顆粒大小的極限。這是在色譜柱達到最佳流速而又不超出市售儀器（使用任何配比的甲醇－水混合溶劑）的壓力限制范圍的條件下，運行系統(tǒng)所能使用的最小顆粒大小。（注意：迄今為止，用于HPLC的最小顆粒是0.67 μm [3]。）
 
如上文所述，范第姆特方程式（及其曲線）表明有必要使用2 μm以下的顆粒，以實現(xiàn)柱效的提高。因此，需要能使UPLC構(gòu)想得以應用于色譜實驗室的技術(shù)革新2。
 

圖3：頂部的色譜圖是分別使用普通（3 μm）HPLC和1.7 μm UPLC得出的5組分混合樣品疊加圖譜。底部的色譜圖是分離過程的前6分鐘的展開圖，表明UPLC提高了分離速度而又使分辨率保持不變。UPLC的溶劑用量也大幅度減少。

更小的顆粒，更大的峰容量
研制并填充2 μm以下的顆粒至可重現(xiàn)而耐用的色譜柱中本身就是一個挑戰(zhàn)。圖4顯示出了目前實驗室常用的5 μm顆粒與建議用于UPLC柱的更小的1.7 μm顆粒的明顯差異。目前，非多孔型1.5 μm顆粒已經(jīng)上市。雖然這類顆粒效率較高，但它們的缺點是表面積較小。表面積小會導致載樣量小和保留時間短。為了與HPLC保持相近的保留時間和載樣量，UPLC必須使用多孔型顆粒。UPLC需要一種新穎的耐高壓多孔型顆粒。填充床的均勻性也是至關(guān)重要的；特別是當較短的色譜柱用以保持分辨率的穩(wěn)定，而同時又要達到加快分離速度的目標時。另一項要求是色譜柱的內(nèi)表面必須足夠光滑，以便于填充較小顆粒。應重新設計色譜柱兩端的篩板，使之既能留住小顆粒又能避免堵塞。

圖4：為了說明5 μm顆粒和1.7 μm顆粒的顯著差異，該掃描電子顯微圖將兩種顆粒與60 μm的人體頭發(fā)相比較。在測量距離相同時，該頭發(fā)的直徑約等于12個5 μm的顆粒，33個1.7 μm的顆粒。

UPLC系統(tǒng)的設計要求
為了達到顆粒小、峰容量大的分離效果，需要比目前使用的HPLC儀具有更廣的壓力范圍。在能達到最大效率的最佳流速下，對于10 cm長裝有1.7 μm顆粒的色譜柱，計算得出的壓力降是~15,000 psi。因此，需要一個能在該壓力下傳送溶劑的泵。另一方面的考慮是在這些條件下，溶劑的可壓縮性將會變得顯著，特別是在多溶劑和梯度分離條件下。UPLC的溶劑傳送系統(tǒng)應不僅僅具有高壓泵抽吸功能，同時在等度和梯度分離模式下使用各種溶劑，溶劑傳送系統(tǒng)必須能抵消溶劑可壓縮性引起的大范圍潛在壓力波動，以實現(xiàn)平穩(wěn)而可重現(xiàn)的流體輸送。

進樣也是很關(guān)鍵。普通進樣閥，不論是手動的還是自動的，都不具有極端壓力下的耐用功能。進樣的可重現(xiàn)性和線性的典型性能標準是分析應用所需要的，但其它特征也是必要的。為保護色譜柱免受極端壓力波動的影響，進樣過程應盡可能排除脈沖干擾。儀器的系統(tǒng)體積要小，以減小所檢測樣品可能的區(qū)帶展寬。在快速進樣循環(huán)中，UPLC能以最大速度、較大的樣品通量進行工作，并可長時間不需人工照看。同時低體積進樣量和最小的交叉污染很好匹配了靈敏度的提高。
 
理論情況下，配備1.7 μm顆粒的UPLC系統(tǒng)能產(chǎn)生半峰寬小于1秒的檢測峰。這給UPLC檢測帶來了挑戰(zhàn)。首先，檢測器必須具有較高的采樣速率，以在檢測峰通過時捕捉足夠的數(shù)據(jù)點，從而對分析物的檢測峰進行準確而可重現(xiàn)的識別（和積分）。其次，檢測器必須有最小的擴散體積，以確保分離效率不降低。檢測器的光學部件也必須具有能體現(xiàn)UPLC靈敏度優(yōu)勢的性能指標。從概念上講，對于不同的檢測技術(shù)，UPLC檢測的靈敏度應是HPLC分離靈敏度的2-3倍（圖5）。例如，質(zhì)譜檢測會極大得益于UPLC的性能特征。檢測峰濃度的提高以及較低流速（不需分流）下減少的色譜擴散將會促進離子源效率的提高，從而使與UPLC相連的質(zhì)譜儀的靈敏度至少提高3倍。

圖5：在進行高峰容量的色譜分析時，降低分析物的色譜展寬可能有助于提高靈敏度。

全面的系統(tǒng)方法
通過思考色譜過程以及如何將這些原理應用于UPLC后明顯發(fā)現(xiàn)：除了化學、泵、進樣器和檢測器之外，還需要對系統(tǒng)進行考慮。系統(tǒng)的體積至關(guān)重要。如果要在色譜分析過程中保持UPLC分離的高性能，則UPLC的系統(tǒng)總體積必須大大低于目前的HPLC系統(tǒng)。還有一點也關(guān)鍵：那就是不僅要仔細考慮上文提到的系統(tǒng)部件的性能規(guī)范，而且需要仔細考慮連接管和接頭配件。為了使UPLC的良好性能得以廣泛應用，有必要制定全面的系統(tǒng)方法，其中既包括所需的性能規(guī)范，也包括對附件變量的控制。

在色譜實驗室可充分發(fā)揮UPLC系統(tǒng)的優(yōu)勢，給實驗室?guī)�來更多益處。用于特征分析的高通量庫篩選能以較快的速度或較好的分辨率完成，而這兩點都能轉(zhuǎn)變?yōu)樾�率的提高。代謝物的識別和生物分析將得益于速度、分辨率和靈敏度的提高。肽圖時間可顯著縮短以加快表征過程。對于肽研究而言，UPLC系統(tǒng)得出圖譜的峰容量更大，比目前使用的HPLC得出的圖譜更精確。穩(wěn)定性指示方法以及方法的總體開發(fā)將會使每次進樣得出更多的信息，同時還會縮短分離時間。色譜分離技術(shù)的最普遍用途——定量分析可以得到更快的的速度，更好的基線分離，從而將會更容易、更可重現(xiàn)進行定量積分，增加了實驗室的生產(chǎn)力和可信度。

UPLCTM：重新定義色譜實驗室
許多科學家曾一度遇到分離障礙，而目前正致力于突破普通HPLC的極限；超高效液相色譜法為擴大和延展這種廣泛應用的分離技術(shù)提供了可能（圖6）。由于UPLC技術(shù)能實現(xiàn)提高液相色譜速度、分辨率和靈敏度的承諾，為每次分析提供更多的信息；因此，該技術(shù)將會得到實驗室的廣泛認可。

圖6：UPLC呈現(xiàn)出全新的速度、分辨率和靈敏度，將會重新定義色譜實驗室。

參考文獻
[1] Anton D. Jerkovich, J. Scott Mellors, and James W. Jorgenson, "The Use of Micrometer-Sized Particles in Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography," LCGC North America Volume 21, Number 7 (2003).
[2] N. Wu, J.A. Lippert, and M.L. Lee, "Practical Aspects of Ultrahigh Pressure Capillary Liquid Chromatography," J. Chromatogr. 911, 1 (2001).
N. Wu, D.C. Collins, J.A. Lippert, Y. Xiang, and M.L. Lee, "Ultrahigh Pressure LiquidChromatography/Time-of-Flight Mass Spectrometry for Fast Separations," J. Microcol. Sep. 12, 462 (2000).
[3] J. M. Cintron, L. A. Colon, "Organo-silica Nanoparticles Used in Ultrahigh- Pressure Liquid Chromatography," The Analyst, 127 (2002) 701 - 704.

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