基因工程，黃金對比：六大病毒載體技術(shù)的比較；不同基因傳遞方法的比較
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病毒載體
經(jīng)典的病毒載體主要有四類，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細胞譜廣，效率高等特點并廣為研究人員熟知。它們的特點總結(jié)歸納如表一。
表一：六大病毒載體技術(shù)的比較
病毒載體介導的基因傳遞的優(yōu)勢
通過表二，可以發(fā)現(xiàn)病毒載體介導的基因傳導方法相比非病毒載體，具備高效，廣譜，長期穩(wěn)定表達以及能用于動物體內(nèi)細胞等幾乎所有優(yōu)點。
表二：不同基因傳遞方法的比較
病毒制備和感染：
腺病毒：
腺病毒基因組非常大，而且酶切位點非常少，導致很難直接制備腺病毒載體。通常通過使用穿梭載體在細菌或者包裝細胞系內(nèi)進行重組從而將外源片段轉(zhuǎn)移到病毒基因組中。
慢病毒：
外源插入片段一旦被克隆至慢病毒載體后，其兩側(cè)為長片段重復序列(LTR)以及
腺相關(guān)病毒：
腺相關(guān)病毒載體含有反向末端重復序列(ITR)。輔助質(zhì)粒用來表達病毒包裝必須基因(E2A, E4 VA and E1)。
注意事項：
插入片段大小和插入片段性質(zhì)因素：一些插入片段的表達由于對宿主或者包裝細胞系有毒性從而使得滴度比較低。在這種情況下，使用誘導表達系統(tǒng)。還有一些插入片段太大或者太小都可能導致病毒包裝效率不高。 添加輔助序列增加插入片段的大小或者對病毒進行濃縮純化提高滴度。插入片段如果過大可以選擇容量更大的病毒包裝系統(tǒng)。
小竅門：
構(gòu)建分子病毒載體時，使用recA-細菌擴增病毒分子載體。當轉(zhuǎn)染包裝細胞時，盡可能使用傳代次數(shù)低的細胞。
注意事項：
使用純度盡可能高的質(zhì)粒，最理想的是經(jīng)過氯化銫密度梯度離心純化的質(zhì)粒。收獲病毒后，推薦進行病毒濃縮并使用病毒純化試劑盒或者氯化銫密度梯度離心純化。
小竅門：
用病毒去感染細胞時，加入polybrene會增加感染效率
小竅門：
將病毒凍存在-80°C。但盡量減少凍融次數(shù)，推薦分裝成單次使用量的小容量包裝。避免反復凍融3次以上。
表三：化學，物理和病毒載體方法進行基因傳遞的具體優(yōu)缺點比較
基因傳遞方法 優(yōu)點 缺點
病毒載體 • 高感染效率，廣譜性高 • 制備復雜
• 適合大規(guī)模實驗操作 • 對病毒載體質(zhì)量要求高
• 能高效感染體內(nèi)細胞 • 需要低溫(-80°C )儲存
• 可以在體內(nèi)感染特定細胞 • 價格偏高
• 易篩選細胞穩(wěn)定株 • 部分病毒載體對基因大小有容量限制
化學方法 • 部分細胞轉(zhuǎn)染效率高 • 廣譜性不高
• 易操作 • 部分試劑毒性大
• 對轉(zhuǎn)染基因大小容量限制小 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果差
• 試劑穩(wěn)定，易儲存
物理方法 • 對大部分體外細胞轉(zhuǎn)染效率高 • 需要購買昂貴設(shè)備
• 易操作 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染可操作性差
• 不受基因大小限制 • 部分原代，非分裂細胞轉(zhuǎn)染效果差
為什么是shRNA？
外源導入的siRNA結(jié)合RISC復合物的能力要比shRNA低10倍，雖然將siRNA的長度增加到29-30 nt可以增加結(jié)合RISC復合物的效率，但也增加了off target效應，引起更多的非專一性基因干擾。shRNA由于模擬microRNA的作用通路，所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的優(yōu)缺點見表四。銳賽選擇使用病毒載體介導的shRNA干擾，并通過構(gòu)建shRNA穩(wěn)定株，能最大程度的避免使用體外化學合成的siRNA所帶來的一系列問題。
a: 1) 改善off target效應; 2) 提高細胞內(nèi)穩(wěn)定性
表六：不同轉(zhuǎn)染方法介導的穩(wěn)定整合參數(shù)比較
表七：不同病毒載體介導的基因傳導的特性比較
病毒載體
經(jīng)典的病毒載體主要有四類，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細胞譜廣，效率高等特點并廣為研究人員熟知。它們的特點總結(jié)歸納如表一。
表一：六大病毒載體技術(shù)的比較
| 載體 | 感染廣譜性 | 靶細胞類型 | 表達形式 | 表達時間 | 免疫原性 | 外源片段容量(Kb) | 滴度(TU/ml) | 缺點 |
| 腺病毒載體 | 高 | 分裂和非分裂 | 非整合 | 2-4周 | 高 | 36 | 1012 | 免疫原性高，瞬時表達 |
| 腺相關(guān)病毒載體 | 中 | 非分裂為主分裂 | 非整合為主;整合 | 數(shù)年 | 無 | 4 | 1012 | 外源片段容量小 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 | 中 | 分裂 | 整合 | 數(shù)年 | 低 | 8 | 108 | 不能感染非分裂細胞 |
| 慢病毒載體 | 高 | 分裂和非分裂 | 整合 | 數(shù)年 | 低 | 5－8 | 1010 | 外源片段容量小 |
| 狂犬病病毒載體 | 對腦神經(jīng)細胞侵染效率高 | 分裂和非分裂 | 整合 | 無 | ||||
| 昆蟲桿狀病毒載體 | 中 | 分裂 | 整合 | 數(shù)年 | 低 | 1012 | 感染譜數(shù)據(jù)庫還有待豐富 |
病毒載體介導的基因傳遞的優(yōu)勢
通過表二，可以發(fā)現(xiàn)病毒載體介導的基因傳導方法相比非病毒載體，具備高效，廣譜，長期穩(wěn)定表達以及能用于動物體內(nèi)細胞等幾乎所有優(yōu)點。
表二：不同基因傳遞方法的比較
| 載體/方法 | 適用靶細胞類型 | 基因傳遞廣譜性 | 動物體內(nèi)基因傳遞能力 | 操作便捷性 | 細胞毒性 | 長期表達能力 | 引起免疫反應 |
| 化學試劑 | 1，部分貼壁細胞 2，部分懸浮細胞 |
低 | 極低 | 高 | 低到中 | 低 | 低 |
| 電轉(zhuǎn) | 1，部分懸浮細胞 2，部分貼壁細胞 |
中 | 可操作性低 | 中 | 低到中 | 低 | 無 |
| 病毒載體 | 1，幾乎所有貼壁細胞 2，幾乎所有懸浮細胞 3，幾乎所有非分裂細胞 |
高 | 高 | 高 | 低 | 高 | 低到中 |
病毒制備和感染：
腺病毒：
腺病毒基因組非常大，而且酶切位點非常少，導致很難直接制備腺病毒載體。通常通過使用穿梭載體在細菌或者包裝細胞系內(nèi)進行重組從而將外源片段轉(zhuǎn)移到病毒基因組中。
慢病毒：
外源插入片段一旦被克隆至慢病毒載體后，其兩側(cè)為長片段重復序列(LTR)以及
腺相關(guān)病毒：
腺相關(guān)病毒載體含有反向末端重復序列(ITR)。輔助質(zhì)粒用來表達病毒包裝必須基因(E2A, E4 VA and E1)。
注意事項：
插入片段大小和插入片段性質(zhì)因素：一些插入片段的表達由于對宿主或者包裝細胞系有毒性從而使得滴度比較低。在這種情況下，使用誘導表達系統(tǒng)。還有一些插入片段太大或者太小都可能導致病毒包裝效率不高。 添加輔助序列增加插入片段的大小或者對病毒進行濃縮純化提高滴度。插入片段如果過大可以選擇容量更大的病毒包裝系統(tǒng)。
小竅門：
構(gòu)建分子病毒載體時，使用recA-細菌擴增病毒分子載體。當轉(zhuǎn)染包裝細胞時，盡可能使用傳代次數(shù)低的細胞。
注意事項：
使用純度盡可能高的質(zhì)粒，最理想的是經(jīng)過氯化銫密度梯度離心純化的質(zhì)粒。收獲病毒后，推薦進行病毒濃縮并使用病毒純化試劑盒或者氯化銫密度梯度離心純化。
小竅門：
用病毒去感染細胞時，加入polybrene會增加感染效率
小竅門：
將病毒凍存在-80°C。但盡量減少凍融次數(shù)，推薦分裝成單次使用量的小容量包裝。避免反復凍融3次以上。
表三：化學，物理和病毒載體方法進行基因傳遞的具體優(yōu)缺點比較
基因傳遞方法 優(yōu)點 缺點
病毒載體 • 高感染效率，廣譜性高 • 制備復雜
• 適合大規(guī)模實驗操作 • 對病毒載體質(zhì)量要求高
• 能高效感染體內(nèi)細胞 • 需要低溫(-80°C )儲存
• 可以在體內(nèi)感染特定細胞 • 價格偏高
• 易篩選細胞穩(wěn)定株 • 部分病毒載體對基因大小有容量限制
化學方法 • 部分細胞轉(zhuǎn)染效率高 • 廣譜性不高
• 易操作 • 部分試劑毒性大
• 對轉(zhuǎn)染基因大小容量限制小 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果差
• 試劑穩(wěn)定，易儲存
物理方法 • 對大部分體外細胞轉(zhuǎn)染效率高 • 需要購買昂貴設(shè)備
• 易操作 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染可操作性差
• 不受基因大小限制 • 部分原代，非分裂細胞轉(zhuǎn)染效果差
為什么是shRNA？
外源導入的siRNA結(jié)合RISC復合物的能力要比shRNA低10倍，雖然將siRNA的長度增加到29-30 nt可以增加結(jié)合RISC復合物的效率，但也增加了off target效應，引起更多的非專一性基因干擾。shRNA由于模擬microRNA的作用通路，所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的優(yōu)缺點見表四。銳賽選擇使用病毒載體介導的shRNA干擾，并通過構(gòu)建shRNA穩(wěn)定株，能最大程度的避免使用體外化學合成的siRNA所帶來的一系列問題。
| siRNA | shRNA | 雙功能shRNA | ||
| RNA干擾片段運輸 | 進入體外細胞 難易程度 |
中等 (轉(zhuǎn)染效率依細胞而定，差異大) | 容易 (使用病毒載體) | 容易 (使用病毒載體) |
| 進入動物體內(nèi) 細胞難易程度 |
低 (轉(zhuǎn)染效率依組織特性而定，且需要較高劑量，可能引起off target效應) | 容易 (使用病毒載體，發(fā)揮功能需要的拷貝數(shù)低) | 容易 (使用病毒載體，發(fā)揮功能需要的拷貝數(shù)低) | |
| 進入細胞的方式 | 化學試劑轉(zhuǎn)染 | 化學試劑轉(zhuǎn)染；病毒載體轉(zhuǎn)導 | 化學試劑轉(zhuǎn)染；病毒載體轉(zhuǎn)導 | |
| 細胞內(nèi)代謝速度 | 強(48小時內(nèi)99%被降解) | 弱 | 弱 | |
| 作用機制 |
結(jié)合RISC復合物能力 | 弱 | 強 (10倍強于siRNA) | 超強 |
| 達到沉默效果需要的拷貝數(shù) | 高 | 低 (5個拷貝左右即可) | 超低 | |
| 脫靶效應 (off target effects) |
化學修飾能力a | 易修飾;修飾價格昂貴 | 無法修飾 | 無法修飾 |
| 免疫信號通路反應 | 中 (通過細胞質(zhì)和內(nèi)涵體通路激活先天性免疫系統(tǒng)) | 弱 (由于使用與內(nèi)源miRNA相似的干擾系統(tǒng)) | 弱 (由于使用與內(nèi)源miRNA相似的干擾系統(tǒng)) | |
| 外源核酸對細胞的毒性 | 中 | 弱 | 弱 | |
| 對細胞內(nèi)源RNA干擾系統(tǒng)的影響 | 中 (過量siRNA會增加飽和exportin-5運輸內(nèi)源miRNA能力的風險性) | 中(瞬時轉(zhuǎn)染引入的高劑量shRNA會增加飽和內(nèi)源miRNA降解能力的風險性)，低(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染) | 中(瞬時轉(zhuǎn)染引入的高劑量shRNA會增加飽和內(nèi)源miRNA降解能力的風險性)，低(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染) | |
| 表達可調(diào)控性 | 可控表達程度 (時間和空間) |
低(可以通過結(jié)合特定的小分子或者大分子達到特異進入某類組織細胞的目的，但無法做到可誘導沉默) | 高 (更換啟動子) | 高 (更換啟動子) |
| 安全性 | 體外和動物體內(nèi) | 高 | 高 | 高 |
| 臨床 | 中 | 中 | 中 |
表六：不同轉(zhuǎn)染方法介導的穩(wěn)定整合參數(shù)比較
| 穩(wěn)定整合參數(shù) | 化學轉(zhuǎn)染法 | 物理轉(zhuǎn)染法 | 病毒載體法 | 轉(zhuǎn)座子 | |||||
| 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 | 電轉(zhuǎn) | 逆轉(zhuǎn)錄病毒 (MLV) |
慢病毒 | 腺相關(guān)病毒(Rep-) | 腺病毒 | 睡美人 轉(zhuǎn)座子 | |||
| 整合幾率(integration event/PFU/cell) | 10-8 | 10-6 | 10-2-10-1 | 10-2-10-1 | 10-3 | 10-6-10-4 | 10-2 | ||
| 整合位點 |
重復序 列片段 |
非核基質(zhì) -嚕噗區(qū) |
核基質(zhì)區(qū) |
CpG島; 核糖體重復序列 |
由于整合率極低，所以很少 研究 |
TA位點 (染色體附近結(jié)構(gòu)決定) | |||
| 轉(zhuǎn)錄起始區(qū) |
活躍表達 基因內(nèi) |
轉(zhuǎn)錄活躍區(qū) 表達調(diào)控區(qū) | |||||||
| 整合位點 轉(zhuǎn)錄活躍度 |
低 | 低 | 高 | 高 | 中 | 高 | |||
| 穩(wěn)定性 | 弱 | 中 | 強 | 強 | |||||
| 拷貝數(shù) |
多拷貝串聯(lián)分布5-數(shù)百個拷貝 | 30%單拷貝 |
通過控制病毒載體用量 可以達到單拷貝 |
通過優(yōu)化實驗條件可以達到單拷貝 | |||||
| 獲得單拷貝細胞株的難易程度 | 難 | 中 | 易 | 易 | 易 | 易 | |||
| 表達強度/拷貝 | 低 | 低 | 高 | 高 | 高 | 高 | |||
| 插入失活宿主 內(nèi)源基因 |
低 | 低 | 低 | 高 | 仍處于研究中 |
高 | |||
| 插入激活宿主 內(nèi)源基因 |
低 | 低 | 高 | 低 | 低 | ||||
表七：不同病毒載體介導的基因傳導的特性比較
| 腺病毒 載體 |
腺相關(guān) 病毒載體 |
逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體 |
慢病毒載體 | 狂犬病 病毒載體 |
桿狀病 毒載體 | |
| 表達形式 | 染色體外， 瞬時表達 |
染色體外，長期表達 | 整合 | 整合 | 整合 | 染色體外，瞬時表達 |
| 表達周期 | 2-4周 | 數(shù)月至數(shù)年 | >1年 | >1年 | >1年 | |
| 感染細 胞類型 |
分裂和 非分裂細胞 |
分裂和 非分裂細胞 |
分裂 |
分裂和 非分裂細胞 |
分裂和 非分裂細胞 |
昆蟲細胞; 哺乳動物分裂細胞 |
| 細胞侵染 廣譜性 |
廣 |
對體內(nèi)分化組織細胞侵染效果更好 | 廣 |
廣 |
高效感染腦神經(jīng)細胞 | 中 |
| 可容納外源片段大小 | 36kb | 4kb | 8kb | 5-8kb | ||
| 滴度 (TU/ml) |
1012 | 1012 | 108 | 1010 | 1012 | |
| 病毒制備 難易程度 |
中 | 難 | 中 | 中 | 中 | 中 |
| 常見應用 | 1，體外細胞基因轉(zhuǎn)導 2，基因治療 |
1，體外細胞基因轉(zhuǎn)導; 2，動物模型; 3，基因治療 |
1，體外細胞基因轉(zhuǎn)導; 2，全基因組插入失活突變篩選; 3，功能細胞庫構(gòu)建 |
1，體外細胞基因轉(zhuǎn)導; 2，基因治療 |
1，體外細胞基因轉(zhuǎn)導; 2，基因治療 |
1，真核細胞蛋白表達(表達可溶性蛋白) |
| 安全性 | 高 | 高 | 中 | 高 | 中 | 高 |
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