細胞P38α激酶活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細胞P38α激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在P38α激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到P38α磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中P38α活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中P38α激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

P38促分裂素原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinases；P38MAPK；EC2.7.11.24），又稱為細胞分裂素特異性結(jié)合蛋白（Cytokinin Specific Binding Protein；CSBP），屬于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）一類中，包括JNK（c-Jun amino terminal kinase）、ERK（細胞外信號相關(guān)激酶；extracellular signal related kinase）、P38、Big MAPK1等的一員。酵母的同源基因為Hog1p。在哺乳動物細胞中，促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路，P38信號通路是其中之一。P38MAPK屬于絲氨酸//蘇氨酸（serine/threonine）蛋白激酶家屬。和ERK和JNK通路一起，將細胞外信號轉(zhuǎn)化為特定細胞反應(yīng)。P38通路受到各種促炎性刺激（proinflammatory stimuli）例如生長因子、激素、GPCR配體、促炎性細胞因子白介素1和8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，以及細胞應(yīng)激（UV、滲透壓休克osmotic shock、內(nèi)毒素、熱休克、化學毒素等）而活化，通過MAPK激酶3和6（MKK3和6）、Jun N-terminal kinase kinase1，以及與MAP3k7IP1/TAB1反應(yīng)，獲得磷酸化后，由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，進而激活下游MK2、MK3、PARK、Mac、MSK、MNK1、轉(zhuǎn)錄因子（STAT1、NFAT、ATF2、MEF2C、P53、CHOP、MAX、CDC25B）、MnSOD等，達到調(diào)節(jié)促炎性細胞因子的轉(zhuǎn)譯、各種細胞外刺激的基因表達、細胞周期、分化、凋亡的調(diào)節(jié)、TNFα、IL1、COX2的生物合成等功能。P38通路異常，將導致風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、銀屑病（psoriasis）和癌癥等，由此P38成為藥物靶標。P38 MAPK蛋白激酶有5個亞酶，包括α（MAPK14/SAPK2A）、β（MAPK11）、γ（MAPK12/ERK6/SAPK3）、δ（MAPK13/SAPK4）、P38-2。其中P38α為廣譜表達，由MAP激酶激酶（MKK）激活以及MAP3K7IP/TAB1蛋白反應(yīng)后激活，其作用底物為ATF2、MEF2C、MAX、CDC2B、P53等，與細胞繁殖、分化、細胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、細胞因子合成、發(fā)育（紅細胞、胎盤）等有關(guān)；P38β為廣譜表達，主要由MAP激酶激酶6（MKK6）激活，其作用底物為ATF2/CREB2；P38γ主要在骨骼肌組織表達，是成肌細胞（myoblast）分化為肌管（myotube）的信號傳導者；P38δ在肺、胰腺、腎、小腸、睪丸等組織高表達，主要由MAP激酶激酶3和6（MKK3和6）激活，其作用底物為ATF2、Tau、Stathmin、eEF2K等，與角質(zhì)形成細胞（keratinocyte）分化有關(guān)。P38α磷酸化目標序列為IPTTPITTTYFFFKKK�；�于底物IPTTPITTTYFFFKKK，在P38α敏感性抑制劑SD169的存在與否的情況下，受到P38a激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析P38a激酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）  毫升

YIJI裂解液（Reagent B）  毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反應(yīng)液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）  微升

YIJI陰性液（Reagent G）  微升

YIJI專性液（Reagent H）  微升

產(chǎn)品說明書     1份

 

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

 

用戶自備

P38α激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品預處理

比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析

 

實驗步驟

• 待測樣品準備
• 準備好75cm²細胞培養(yǎng)瓶或100mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁷細胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準備
• 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 

 

• 樣品總活性測定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 

 

• 樣品非特異活性測定

 

檢測開始前，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

 

• 計算樣品活性

 

• 樣品總活性和非特異活性計算

 

 

2）樣品特異活性計算

 

 

七、酶標儀測定

 

• 樣品總活性測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

 

 

• 樣品非特異活性測定

 

檢測開始前，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：待測樣品
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

 

 

• 樣品特異活性計算

 

 

八、抑制劑篩選

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進行樣品預處理

 

內(nèi)容物	空背景對照	樣本背景	完全酶活性	待測抑制劑酶活性
YIJI緩沖液（Reagent C）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
YIJI陰性液（Reagent G）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待測抑制劑	——	xx微升	――	xx微升
用戶自備的純化酶	——	——	xx微升（1毫單位）	xx微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對照孔 （xx微升）	樣本背景孔 （xx微升）	完全活性孔 （xx微升）	待測抑制劑樣品孔 （xx微升）
輕輕搖動96孔板，混勻，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進行下列操作

 

• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 即刻放進30℃酶標儀檢測：測讀30分鐘
• 抑制活性計算：

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 如果出現(xiàn)明顯的干擾現(xiàn)象，建議使用樣本背景對照去除任何內(nèi)源性干擾因子
• 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用P38α抑制劑（VX745；IC50=10納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• P38α激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.6條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感