“為什么很難用臺盼藍染色劑來計數(shù)PBMC！有大的，小的，成團的……；你能告訴我怎么在未染色的細胞中挑出有核細胞？”小編經(jīng)常被問到各種各樣關于如何計數(shù)PBMC的問題，今天就借此機會跟大家分享一下。
 
首先，了解下人類PBMCs的組成

      外周血單核細胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC),大部分都是淋巴細胞，包括B細胞和T細胞，其中CD3 T細胞又占了淋巴細胞中絕大部分(45-70%)。相對于淋巴細胞，單核細胞的比例在10-30%，受到刺激之后會發(fā)育成樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞。干細胞的比例非常低，只有0.1-0.2%。紅細胞和血小板沒有核，主要負責運送氧。
 

 

傳統(tǒng)計數(shù)PBMCs的方法

     原代細胞，對于傳統(tǒng)的計數(shù)方法，絕對是一種挑戰(zhàn)！原代細胞懸液中包含各種異質(zhì)性的細胞類型和在消化過程中產(chǎn)生的細胞碎片。而且，因為樣品采集的部位不同，來源的病人不同，以及分離過程中的差異，樣品往往千差萬別。PBMC研究要求精確地判斷細胞死活，數(shù)量等等，對于進行后續(xù)的實驗非常重要。
 
     在傳統(tǒng)的血球計數(shù)板+顯微鏡模式下，很難把PBMC細胞和紅細胞分開來。PBMC細胞在光鏡下，和腫瘤細胞相比很小，紅細胞兩面凹的形態(tài)，只能通過經(jīng)驗和更加靈敏清晰的顯微鏡進行人為識別。因此引入太多的人為因素，而導致誤差極大，也會使操作者疲憊不堪。

      因此有研究人員嘗試用臺盼藍進行PBMC的死活的鑒定。臺盼藍是組織和細胞培養(yǎng)中最常用的死細胞鑒定染色方法之一�；罴毎�不會被染成藍色，而死細胞會被染成淡藍色。    PBMC分離過程中，會有紅細胞的殘留，雖然紅細胞沒有核，但是大小與PBMC接近；因為胞膜完整，所以紅細胞也不會被染成藍色，因此傳統(tǒng)臺盼藍方法不能分辨紅細胞與活的PBMC，紅細胞也將被誤認為是PBMC細胞，影響PBMC的活率和活細胞總數(shù)。

另外，PBMC實驗還有其自身的特點：1. 隨著時間的延長，細胞質(zhì)量下降；2. 許多單細胞測序的相關實驗，需要快速準確計數(shù)細胞死活和判斷細胞結團情況，決定樣本是否適合上機檢測。所以，快速計數(shù)，并得到準確的結果是保證后續(xù)實驗順利進行的關鍵。
 
精準的熒光計數(shù)法

      公認標準的熒光細胞計數(shù)法采用AO/PI染料雙染細胞核來檢測細胞的狀態(tài)。AO/PI試劑由可以發(fā)出綠色熒光的DNA結合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡稱AO）和可以發(fā)出紅色熒光的DNA結合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，簡稱PI）組成。其中AO可以通過完整的細胞膜，嵌入所有細胞（活細胞和死細胞）的細胞核，呈現(xiàn)綠色熒光；PI只能通過不完整的細胞膜，即死細胞的細胞膜，嵌入所有死細胞的細胞核，呈現(xiàn)紅色熒光。

      當兩種染料均存在于細胞核內(nèi)，在合適的AO、PI配比下，兩種染料發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，死細胞在綠色通道下激發(fā)出紅色熒光。由于AO和PI為DNA結合染料，因此可有效排除雜質(zhì)以及紅細胞的干擾，確保對樣品進行準確計數(shù)。
 

 

上圖為我們使用美國DeNovix公司的CellDrop FL 熒光細胞計數(shù)儀采用AO/PI染料，10秒內(nèi)即可完成對PBMCs的準確計數(shù)。

建議

      所以，就不要再用明場或是借助臺盼藍進行PBMCs細胞死活計數(shù)了。用AO/PI染料結合熒光計數(shù)儀，才是PBMCs精確計數(shù)和活力分析的金標準。