在我們的課題研究中，很多小伙伴們應該都涉及到基因功能的研究。在基因功能研究過程中，我們少不了要去給這個基因進行過表達、敲除或者敲低的操作。這樣我們就需要構建表達載體（過表達，敲除或者敲低），并將構建好的表達載體轉染至我們的細胞或者實驗動物內，進而便可研究我們的基因在細胞或者生物體內所執(zhí)行的功能和扮演的角色。

 

       可在構建表達載體的時候 ，我們要如何選擇合適自己實驗需要的載體呢？載體可分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體又分為慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體等。今天我們就來說說病毒載體中的慢病毒載體。

 

       一、慢病毒

 

       逆轉錄病毒（Retrovirus）：是一種RNA病毒，在復制時需在逆轉錄酶的作用下首先將RNA轉變?yōu)閏DNA， 再在DNA復制、轉錄、翻譯等蛋白酶作用下擴增。主要包括RNA腫瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三種亞科。

 

       慢病毒（Lentivirus）：屬于逆轉錄病毒科，名稱源自該種病毒長達數(shù)年的潛伏期。

 

       最經(jīng)典的慢病毒是由HIV病毒改造而來，而且HIV-1/HIV-2系統(tǒng)也得到了廣泛的應用，除了HIV病毒系統(tǒng)以外，后續(xù)還有猿類免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）載體系統(tǒng)、貓免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）載體系統(tǒng)、綿羊梅迪-維斯納病毒（MMV）載體系統(tǒng)和馬傳染性貧血(EIA）載體系統(tǒng)等。

 

 

       慢病毒結構：

 

       2個調節(jié)基因：

 

    （1）tat基因：反式激活因子，對HIV基因起正調控作用。

 

    （2）rev基因：病毒蛋白表達調節(jié)因子，增加gag和env基因對結構蛋白的表達。

 

       4個輔助蛋白（附屬）基因：

 

    （1）vif和vpu調節(jié)感染性病毒顆粒的產生；

 

     （2）vpr和nef參與疾病的表現(xiàn)。

 

 

       慢病毒的優(yōu)勢：

 

       1.慢病毒攜帶的基因組可整合到宿主基因組，使宿主細胞長時間穩(wěn)定表達外源基因；

       2.可感染分裂和非分裂細胞；

       3.低免疫原性，直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用于動物實驗；

       4.可以更換特異性啟動子；

       5.野生型的HIV大小約為9.8 kb，插入片段可長達5-6 kb；

       

       二、慢病毒載體

 

       慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒�？衫�用逆轉錄酶將外源基因整合到基因組中實現(xiàn)穩(wěn)定表達，具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。

 

       慢病毒載體組分：

 

       慢病毒載體系統(tǒng)：包裝成分和載體成分

 

       產生慢病毒顆粒的輔助成分：慢病毒包裝質粒和包裝細胞系。

 

       慢病毒載體包含了包裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。

 

       慢病毒包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構建到兩個質粒上，一個質粒表達Gag和Pol蛋白，另一個質粒表達Env蛋白，其目的也是降低恢復成野生型病毒的可能。

 

       將包裝成分與載體成分的3個質粒共轉染包裝細胞(如人腎293T細胞)，即可在細胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

 

       慢病毒包裝過程：

 

       慢病毒基因組進入細胞后，在細胞漿中反轉錄為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產生小RNA。慢病毒介導的基因表達或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細胞基因組的分裂而分裂（圖1）。

 

 

慢病毒包裝和侵染細胞的過程（元和生物）

 

       三、慢病毒的使用和優(yōu)勢

 

       慢病毒的使用量的取決因素：滴度， 感染體積 ，MOI ，細胞密度

 

       滴度（Titer）：單位體積液體中有感染能力的病毒或噬菌體數(shù)目。單位：TU/mL （活性滴度單位）、copies/mL （物理滴度單位）

 

       檢測方法：定量PCR檢測干擾后細胞基因組中外源DNA拷貝數(shù)。

 

       實驗原理：慢病毒介導外源基因以逆轉錄方式整合進目的細胞基因組。

 

 

       MOI（multiplicity of infection）：感染復數(shù)或者復感染指數(shù)。指感染時病毒和細胞數(shù)量的比值。在實驗中也將某個細胞達到 80%感染時所需的MOI 值定義為這個細胞的MOI值。加的病毒量(μl)=細胞數(shù)×MOI/滴度(…/ml) ×1000。

 

       慢病毒載體的優(yōu)勢：

 

  （1）表達時間長：慢病毒可將外源基因整合到宿主細胞基因組上，實現(xiàn)基因長時間穩(wěn)定的表達，不隨細胞分裂傳代而丟失，是細胞實驗的首選，常用于構建穩(wěn)轉株。

 

   （2）安全性高：未發(fā)現(xiàn)致病性，慢病毒載體改造T細胞用于CAR-T細胞治療。

 

    （3）免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用于動物實驗。

 

       應用：

 

       1.基因治療

       2.轉基因動物

       3.基因敲除

       4.藥物研究

       5.慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、內皮細胞、干細胞等多種類型原代細胞和大部分細胞系。

       6.慢病毒的感染具有整合特性，能夠將外源基因有效地整合到宿主染色體上，因而可以達到持       久性表達，從而構建穩(wěn)轉細胞株，用于基因的細胞功能研究。

       7.快速建立生產目的蛋白的細胞系，非常有前途的真核表達方法。

 

       說到這里，大家是不是對慢病毒載體有了一點了解呢？接下來小編給大家推薦一些Genecopoeia有關慢病毒方面的產品：

 

     （1）首先是關于慢病毒載體構建方面的產品：

 

       ORF表達克隆，shRNA克隆，miRNA前體表達克隆，miRNA inhibitor克隆，啟動子報告克隆，CRISPR-Cas9相關克隆均可構建喲，全方面滿足大家的需求。

 

       1.ORF表達克隆產品

 

慢病毒貨號	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-貨號-載體-100	ORF/Promoter/lncRNA 慢病毒	ORF： ≥ 10^8 TU/ml * Promoter：N/A	100ul（50ul× 2管)	1×10^7 TU
LPP-貨號-載體-400			400ul（50ul× 8管)	4×10^7 TU
LPP-貨號-載體-A00			1000ul（50ul× 20管)	1×10^8 TU
LPP-貨號-載體-A05			大包裝 5 ml (默認200ul× 25管)	5×10^8 TU
LPP-貨號-載體-A10			大包裝 10 ml (默認200ul× 50管)	1×10^9 TU

 

       2.shRNA克隆產品

 

慢病毒貨號	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-貨號-載體-050	shRNA慢病毒	≥ 2×10^8 TU/ml	單條50ul（50ul× 1管)      一套3條 單條50ul（50ul× 1管)	1×10^7 TU
LPP-貨號-載體-200			單條200ul（50ul×4管) 一套3條 每條200ul（50ul×4管) *3	4×10^7 TU
LPP-貨號-載體-500			單條500ul(50ul×10管) 一套3條 每條500ul(50ul× 10管) *3	1×10^8 TU
LPP-貨號-載體-A00			單條1000ul（50ul×20管) 一套3條 單條1000ul（50ul×20管)*3	2×10^8 TU
LPP-貨號-載體-A10			5 ml (默認200ul× 25管)	2×10^9 TU

       3.miRNA克隆產品
 

慢病毒貨號	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-貨號-載體-050	miRNA/inhibitor 慢病毒	≥ 2×10^8 TU/ml	50ul（50ul× 1管)	1×10^7 TU
LPP-貨號-載體-200			200ul（50ul× 4管)	4×10^7 TU
LPP-貨號-載體-500			500ul(50ul× 10管)	1×10^8 TU
LPP-貨號-載體-A00			1000ul（50ul× 20管)	2×10^8 TU
LPP-貨號-載體-A10			5 ml (默認200ul× 25管)	2×10^9 TU
LPP-貨號-載體-025	對照慢病毒	≥ 10^8 TU/ml	25ul （25ul× 1管）	0.25×10^7 TU
LPP-貨號-載體-100			100ul （25ul× 4管）	1×10^7 TU
LPP-貨號-載體-200			200ul （25ul× 8管）	2×10^7 TU
LPP-貨號-載體-400			400ul （25ul× 16管）	4×10^7 TU
LPP-貨號-載體-A00			1000ul （100ul × 10管）	1×10^8 TU

 

       4.Cas 9 和sgRNA克隆產品
 

慢病毒貨號	描述	滴度	體積及規(guī)格	慢病毒總量
LPP-CP-LvC9NU-載體-100	Cas9 慢病毒	1x10^6 - 1x10^7 TU/ml	100 µl (50ul×2管)	> 1x10^6 TU
LPP-CP-LvC9NU-載體-400			400 ul(50ul×8管)	> 4x10^6 TU
LPPHCP[gene]L03-1-200 LPPHCP[gene]L03-3-200	sgRNA慢病毒	≥ 10^8 TU/ml	單條200ul（50ul×4管) 一套3條 每條200ul（50ul×4管)*3	單條： 2×(10^6-10^7)TU 一套3條 每條： 2×(10^6-10^7)TU
LPPCCPCTR01L03-100	sgRNA對照慢病毒	≥ 10^8 TU/ml	100ul（25ul× 4管)	1×10^7 TU
LPPCCPCTR01L03-400			400ul（25ul× 16管)	4×10^7 TU

 

      （2）慢病毒包裝服務產品（慢病毒顆粒，病毒濃縮，包裝細胞系等）

 

產品	描述	用戶手冊/數(shù)據(jù)表
LT001	基于HIV骨架的慢病毒顆粒包裝試劑 (20 reactions)	HIV-based lentiviral packaging plasmids, eGFP control clone and EndoFectin Lenti Transfection Reagent
LT002	基于HIV骨架的慢病毒顆粒包裝試劑 (40 reactions)	HIV-based lentiviral packaging plasmids, eGFP control clone and EndoFectin Lenti Transfection Reagent
LT003	基于HIV骨架的慢病毒顆粒包裝試劑 (5 reactions)	HIV-based lentiviral packaging plasmids, eGFP control clone and EndoFectin Lenti Transfection Reagent
LT005	基于qRT-PCR技術的HIV骨架慢病毒顆粒滴度檢測試劑 （20次RT反應 +50次PCR反應）	qRT-PCR based titration to determine the copy numbers of HIV lentiviral particles.
LT006	基于qRT-PCR技術的HIV骨架慢病毒顆粒滴度檢測試劑 （40次RT反應 +100次PCR反應）	qRT-PCR based lentiviral titration to determine the copy numbers of HIV lentiviral particles.
LT007	慢病毒濃縮試劑盒（50 ml）	Quick and simple concentration of lentiviral particles
LT008	293Ta慢病毒顆粒包裝細胞系 (1.5 x 106 cells)	293Ta Lentiviral packaging cell line
MP002	MycoGuard™ Mycoplasma Bioluminescent Detection Kit(10 次反應)	應用生物熒光，可快速、簡單檢測出細胞培養(yǎng)過程中存在的支原體。
MP003	MycoGuard™ Mycoplasma Bioluminescent Detection Kit(50 次反應)	應用生物熒光，可快速、簡單檢測出細胞培養(yǎng)過程中存在的支原體。
MP004	MycoGuard™ Mycoplasma PCR Detection Kit 2.0(50 次反應)	利用PCR技術快速檢測細胞培養(yǎng)過程中存在的支原體。

 

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