“我明明按照操作步驟來，為什么就是跑不出？”“為什么我的 WB 總是跑得不干凈？”“日常羨慕文獻里漂亮的 WB 結(jié)果”，小小 Western Blot 難倒一片科研黨，又泡了一年實驗室的萌 Cece 已略有經(jīng)驗~~好東西當(dāng)然要分享啊~~

 

 

元氣滿滿的一天，相信今天一定會跑出漂亮的條帶。我的小幸福就是看到目的蛋白的那一刻！

 

看我一頓操作猛如虎：
電泳 → 轉(zhuǎn)膜 → 封閉 → 孵一抗 → 孵二抗 → 檢測，剩下的就是等待。

 

圖 1. Western blot 操作流程簡介^[1]

 

理想很豐滿，現(xiàn)實很骨感，像在某寶買東西寫差評：跟想象中不一樣。順便再曬幾張“辣眼”買家秀以證現(xiàn)實的殘酷。我的實驗結(jié)果中出現(xiàn)了各種稀奇古怪的玩意兒？？？

 

■ 古怪一：高背景

 

 

 萌 Cece 分析：

1、洗滌不充分，膜沒有洗干凈。

2、封閉不充分，一抗可能直接結(jié)合到膜上，造成二抗孵育時在非特異性位點發(fā)生結(jié)合。

3、一抗/二抗?jié)舛忍�高，出現(xiàn)非特異性結(jié)合。

 

 措施：

1、對于洗滌不充分，可適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和時間，也可嘗試提高洗滌液中 Tween-20 的含量 (如提高至 0.5-1%) 。

2、要解決封閉不充分這個問題，可嘗試延長封閉時間，也可更換封閉液。常用的封閉劑有 5% 脫脂奶粉、5% BSA、血清和明膠等，推薦室溫封閉 1 小時以減少背景。另外，脫脂奶粉常含有酪蛋白，由于酪蛋白會結(jié)合磷酸化抗體而易產(chǎn)生高背景。因此，檢測磷酸化蛋白時建議用 BSA 作為封閉劑。

3、如果一抗/二抗?jié)舛忍�高，出現(xiàn)非特異性結(jié)合，洗滌也無法完全去除，建議設(shè)置多個抗體稀釋梯度，從而篩選出合適的抗體比例。
 

■ 古怪二：斑點

 

 
 萌 Cece 分析： 

封閉液中出現(xiàn)了不溶性物質(zhì)。

 
 措施： 

建議將封閉液充分溶解后進行過濾。

 

■ 古怪三：最頭疼的，沒有按照預(yù)期結(jié)果出現(xiàn)令人滿意的條帶，如：加入 p38 抑制劑，但 p-p38 表達量沒有變化。

 

 
 萌 Cece 分析：
p38 雖然在不同的細胞中廣泛表達，但是在沒有誘導(dǎo)的情況下，表達量很低。
 

 措施： 

為了成功檢測到 p38 的表達，建議：

1、使用陽性對照確保實驗體系沒有問題。

2、根據(jù)實驗設(shè)計與需求使用誘導(dǎo)物 (如 LPS) 提高表達量。

 

圖 2. LPS 處理前后 p38 表達量對比^[2]

 

SB202190 是一種選擇性的 p38 MAPK 抑制劑。SB202190 與 p38 激酶的 ATP 袋結(jié)合。

 

圖 3. 在 LPS 誘導(dǎo)的情況下， SB202190 抑制 p38 磷酸化水平^[3]

 

SB203580 是一種 p38 MAPK 的選擇性抑制劑。SB203580 抑制 p38 活性時，只抑制了由誘導(dǎo)劑 (如 LPS) 引起的 p-p38 增加量，但不改變 p-p38 的基礎(chǔ)水平。這是由于 p38 的自身磷酸化，是不受 SB203580 影響的。

 

SB203580 通過降低下游 MAPKAPK2，HSP27 和 ATF2 磷酸化來調(diào)節(jié) p38 MAPK 信號通路。SB203580 通過結(jié)合 ATP 結(jié)合區(qū)來抑制 p38 MAPK 的催化活性，但不能抑制上游激酶對 p38 MAPK 的磷酸化。

 

圖 4. SB203580 作用機制^[4]

 

So，找到了原因咱再來一次就離成功不遠啦！陽光耀眼，樂觀地，向前走！
 
除了以上建議外，萌 Cece 還有一些超實用法寶：
1、在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制劑 (HY-K0011，HY-K0010)。

2、檢測磷酸化蛋白時，加入磷酸酶抑制劑 (HY-K0021，HY-K0022，HY-K0023)。

3、建議使用 RIPA 裂解液 (強) (HY-K1001)。

4、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用麗春紅染色確認轉(zhuǎn)膜效果。

5、選用高靈敏度的 ECL 發(fā)光液, 特超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒 (HY-K1005)。

 

參考文獻

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1. Dae-Eun Jeong, et al. Western Blot Analysis of C. elegans Proteins. Methods Mol Biol. 2018; 1742: 213-225.

2. Weiju Wang, et al. Role of TLR4-p38 MAPK-Hsp27 signal pathway in LPS-induced pulmonary epithelial hyperpermeability. BMC Pulm Med. 2018 Nov 27; 18(1): 178. 

3. Yong Li, et al. Mogroside V inhibits LPS-induced COX-2 expression/ROS production and overexpression of HO-1 by blocking phosphorylation of AKT1 in RAW264.7 cells. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2019 Apr 1;51(4):365-374.

4. Gopinathan Pillai Sreekanth, et al. SB203580 Modulates p38 MAPK Signaling and Dengue Virus-Induced Liver Injury by Reducing MAPKAPK2, HSP27, and ATF2 Phosphorylation. PLoS One. 2016 Feb 22; 11(2): e0149486.