hACE2人源化小鼠在長春獸醫(yī)研究所新冠疫苗開發(fā)上取得新進展中的應用
新冠（COVID-19）大流行已持續(xù)三年，全球感染病例超過6.7億例，死亡病例超過670萬例。世界衛(wèi)生組織在不久前宣布，盡管新冠大流行可能正接近轉折點，但仍然構成“國際關注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”。因此，目前迫切需要一種有效的疫苗來預防新冠病毒（SARS-CoV-2）。
近日，中國農業(yè)科學院長春獸醫(yī)研究所團隊在新冠疫苗開發(fā)上取得新進展。他們在《International Journal of Molecular Sciences》雜志上發(fā)表論文，強調了S蛋白RBD三聚體在新冠疫苗開發(fā)中的重要性，并為開發(fā)針對RBD結構域的保護性疫苗提供了理論依據(jù)。
研究材料與方法
研究人員選擇了桿狀病毒表達系統(tǒng)來表達重組的RBD蛋白三聚體。在純化和鑒定蛋白后在hACE2人源化小鼠（賽業(yè)生物提供）上開展了動物免疫接種實驗，并通過ELISA分析評估了SARS-CoV-2特異性抗體的水平。隨后用病毒感染的hACE2小鼠評估RBD-6HB疫苗的保護作用，作者通過RT-qPCR方法檢測了病毒載量，并開展了組織學分析。
技術路線
01 設計和構建表達RBD-6HB的重組桿狀病毒
02 對RBD-6HB重組蛋白進行表達、純化和鑒定
03 在hACE2小鼠上評估RBD-6HB疫苗的免疫原性
04 評估RBD-6HB疫苗對hACE2小鼠的保護作用
研究結果
1 RBD-6HB重組蛋白的構建和表達
眾所周知，新冠病毒進入細胞是由S（刺突）蛋白介導的，S蛋白自組裝成同源三聚體，在病毒表面形成特殊的花冠結構。S蛋白上的受體結合結構域（RBD）與宿主細胞的ACE2受體結合，因此可作為開發(fā)中和抗體的主要目標。
研究人員推測，與原生結構相似的三聚體可能會增加RBD的免疫原性，因此，他們將六螺旋束（6HB）添加到RBD蛋白的C端，使其形成穩(wěn)定的三聚體結構。6HB是一種熱穩(wěn)定的三聚體結構域，來源于HIV的gp41蛋白，在此作為“分子鉗”以增加病毒蛋白的穩(wěn)定性。他們選擇桿狀病毒系統(tǒng)來表達去糖基化的RBD蛋白（RBDΔN1）與6HB的融合體，因為去除糖基化位點可增加蛋白表達，并維持其抗原性和功能。
三種重組桿狀病毒的示意圖
重組桿狀病毒rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB以及對照（RBD和6HB）的構建過程如圖1所示。研究人員用重組桿狀病毒感染sf9細胞后，開展Western blot分析，發(fā)現(xiàn)RBD-6HB蛋白在感染的細胞中有效表達。他們在收集培養(yǎng)上清液后進行蛋白純化，獲得了純度高達97%的蛋白質。他們還發(fā)現(xiàn)，RBD-6HB蛋白能夠形成三聚體（分子量約為120 kDa），這一點通過SDS-PAGE和Western blot得到了驗證。
2 RBD-6HB疫苗對小鼠的完全保護
之后，研究人員在hACE2人源化小鼠上評估了RBD-6HB三聚體的免疫原性，這種穩(wěn)定表達人類ACE2受體的人源化ACE2小鼠是由賽業(yè)生物構建的。他們將6周齡的hACE2小鼠隨機分為三組，將指定的蛋白和佐劑注射到小鼠體內。加強免疫后，他們發(fā)現(xiàn)RBD-6HB在氫氧化鋁和CPG佐劑存在的情況下能夠刺激小鼠持續(xù)產生高水平的抗體，且RBD-6HB組的抗體滴度高于RBD組（圖2）。同時，與對照組相比，疫苗組小鼠的食量和活動情況無明顯差異，表明疫苗的刺激性較小。
在小鼠中接種疫苗后的血清抗體反應
最后，研究人員還評估了RBD-6HB疫苗對小鼠的保護作用。他們將新冠病毒注射到hACE2小鼠體內。根據(jù)qPCR檢測的結果，RBD-6HB+佐劑組中SARS-CoV-2的N基因表達量比6HB組低100倍，比RBD+佐劑組低50倍，這表明候選疫苗具有中和病毒的作用。同樣地，RBD-6HB+佐劑組中SARS-CoV-2的E基因表達量也低于對照組，表明候選疫苗可能具有抑制病毒體內復制的作用。
組織學分析顯示，RBD-6HB組小鼠的肺組織表面被覆一層光滑的漿膜，顯示完整的肺泡結構，無明顯異常，而對照組則存在炎癥細胞浸潤，血管充血和肺泡擴張（圖3）。這些結果表明，RBD-6HB疫苗能夠建立有效的保護屏障，幫助小鼠抵御新冠病毒感染。
RBD-6HB疫苗對hACE2小鼠的保護
研究結論
綜上所述，三聚體結構的RBD-6HB蛋白在佐劑存在的情況下能夠誘導機體產生特異性抗體。RBD-6HB疫苗對hACE2小鼠具有保護作用，有效降低了肺部的病毒載量，減少了炎性組織損傷。這項研究突出了RBD結構域在新冠疫苗設計中的重要性，為保護性疫苗的開發(fā)提供了理論基礎。
原文檢索：
[1] Qu Q, Hao P, Xu W, Li L, Jiang Y, Xu Z, Chen J, Gao Z, Pang Z, Jin N, Li C. A Vaccine of SARS-CoV-2 S Protein RBD Induces Protective Immunity. Int J Mol Sci. 2022 Nov 8;23(22):13716. doi: 10.3390/ijms232213716.
