支原體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)(QPCR法）

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【產(chǎn)品規(guī)格】

BPM50 50 次/盒

【產(chǎn)品說(shuō)明】

支原體(mycoplasma)：目前發(fā)現(xiàn)的最小的原核生物，據(jù)統(tǒng)計(jì)約 15~35% 的細(xì)胞被支原體污染。支原體污染會(huì)改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，易致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，須對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)。

本產(chǎn)品試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針?lè)?檢測(cè)支原體DNA，檢測(cè)對(duì)象為細(xì)胞培養(yǎng)的上清液或細(xì)胞本身。該試劑盒具有以下特點(diǎn)：

靈敏：配合高效 DNA 提取試劑盒，檢測(cè)靈敏度達(dá) 10cfu/mL。

穩(wěn)定：全程閉管操作，無(wú)交叉污染。

可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。

方便：操作簡(jiǎn)單，無(wú)需電泳步驟。

定量：以 CT 值判斷，可定量檢測(cè)。

【運(yùn)輸及保存條件】

低溫冷凍運(yùn)輸， -20℃保存，有效期 1 年。

【產(chǎn)品組分】

組分名稱 BPM50
Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 900µL

Mycoplasma Positive Control 100µL

RNase Free Water 100µL

注：Positive Control 濃度為 2×10 3拷貝/µL。本試劑盒提供試劑，使用前先低速離心后小心開(kāi)啟。使用時(shí)請(qǐng)上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

【操作步驟】

1. 樣本制備（自備）

A 樣本的標(biāo)準(zhǔn)制備方案：請(qǐng)使用高效DNA 提取試劑盒取樣本 DNA。推薦使用無(wú)微生物污染級(jí)別的核酸提取試劑盒。低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等生物制品，即使存在支原體污染，一般支原體含量也較少，建議提取樣本DNA 后檢測(cè)。

B 樣本的簡(jiǎn)易快速制備方案：可用于細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞懸液、血液，樣本制備步驟如下。

（1）細(xì)胞培養(yǎng)上清：取 1~1.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)上清；

（2）細(xì)胞懸液：直接取 2µL 細(xì)胞懸液作為模板進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。要求樣本內(nèi)細(xì)胞總數(shù)量不超過(guò) 10000 個(gè)，樣本可用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋400 rpm 離心 3 分鐘；取 2µL 上清作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

（3）血液：直接取血液樣本作為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。注意血液中的細(xì)胞對(duì)PCR反應(yīng)有較強(qiáng)抑制作用，內(nèi)參檢測(cè)通道會(huì)顯示異常。根據(jù)不同應(yīng)用場(chǎng)景，有兩個(gè)建議：①中間質(zhì)控環(huán)節(jié)，對(duì)靈敏度要求中等，無(wú)需達(dá)到10cfu/mL，可用無(wú)菌水稀釋 10 倍，充分混勻后，取 2µL作為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。②放行檢測(cè)，要求靈敏度達(dá)到10cfu/mL，建議提取樣本DNA 后檢測(cè)。

2. qPCR 反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系以20µL為例：

PCR 儀設(shè)置以 ABI 7500 為例，相對(duì)定量模式，選擇

TaqMan 探針?lè)ǎ?/div>

【閾值設(shè)置】

以ABI 7500 為例，擴(kuò)增曲線選擇 log 法，基線設(shè)置3~15 個(gè)循環(huán)。建議用 log 法擴(kuò)增曲線保證結(jié)果穩(wěn)定可靠。

（1）內(nèi)參(HEX/VIC)閾值設(shè)定：以陰性對(duì)照定內(nèi)參擴(kuò)增曲線閾值，將內(nèi)參的CT 值定為 27±2。

（2）支原體(FAM)閾值設(shè)定：以陽(yáng)性對(duì)照定支原體擴(kuò)增曲線閾值，將支原體(FAM)的CT值定為 26±3。

說(shuō)明：

如果陽(yáng)性對(duì)照管的支原體(FAM)CT 值>30，但陽(yáng)性對(duì)照管及陰性對(duì)照管的內(nèi)參(HEX)CT 值正常，表明陽(yáng)性支原體對(duì)照模板有降解。

如果陰性對(duì)照管的內(nèi)參(HEX/VIC)CT值>30，陽(yáng)性對(duì)照管的內(nèi)參(HEX)CT值>30 且支原體(FAM)CT值>30，表明 Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 試劑成分已失效。

【結(jié)果判讀】