近些年，隨著生物醫(yī)藥迅猛發(fā)展、疫情下細胞基因治療以及mRNA疫苗的相繼涌現，如何把控生物制品安全可靠，成為各國法規(guī)政府重視以及監(jiān)管的要點。支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染”。

監(jiān)管機構要求的支原體檢測點

2020版中國藥典三部《生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制》中提出對于生產用細胞，需要對主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）、生產終末細胞（EOPC）進行支原體檢查。

《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中建議在關鍵時間點對適合的中間樣品開展支原體等安全性相關檢測或采取相關的措施加以控制，并且支原體同樣需要作為終產品的放行檢項。

FDA,Guidance for Industry:Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，中提出對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。

NAT法和傳統(tǒng)方法

在快速檢測方法（NAT，核酸擴增技術）出現之前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和指示細胞法因其檢測周期長或靈敏度問題，致使企業(yè)生產或產品放行周期拉長或者需要基于風險評估對細胞原料進行條件放行或者尋求其他替代方法。而隨著細胞基因治療的發(fā)展，行業(yè)內對支原體檢測時效性和靈敏度要求越來越高，短的貨架期不足以支撐如此長的檢測周期，因此NAT方法從眾多支原體檢測方法中脫穎而出。

目前歐洲藥典（EP）<2.6.7>，日本藥典（JP）以及美國藥典（USP）<63>都已收錄NAT方法作為支原體檢測方法，但需要對該方法進行驗證以及與傳統(tǒng)方法進行對比其檢測靈敏度不低于傳統(tǒng)方法，才可以使用。2020版中國藥典（ChP）雖然并未收錄NAT法作為支原體檢測方法，但其中也提到了“也可采用經國家藥品檢定機構認可的其他方法”。2022年5月，國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中提到“當檢驗樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無法滿足，可考慮開發(fā)新型的無菌和支原體的檢測方法進行放行檢測，但是新型檢測方法應經過充分驗證”。所以NAT法有望作為能夠支持快速支原體放行檢測的方法，被越來越多的原材料供應商、以及ATMP企業(yè)所使用。

NAT法-方法驗證要求

對于如何進行NAT方法的驗證，目前歐洲藥典<2.6.7>和日本藥典里都詳細介紹，其內容基本一致。中檢院也發(fā)表了文章《支原體檢查的核酸檢測方法及方法學驗證的思考》，以期對我國支原體核酸擴增法檢測的研發(fā)者及使用者提供借鑒。支原體NAT法須進行專屬性（Specificity）、檢測限（Detection Limit）和耐用性（Robustness）驗證。如果使用商業(yè)化試劑盒進行支原體檢測，則可以基于供應商的完整試劑盒性能驗證報告再結合本身實驗室環(huán)境和樣品類型進行合適的方法適用性驗證。

專屬性（Specificity）

專屬性系指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。EP中提到需要在驗證中關注與系統(tǒng)發(fā)育關系比較近的其他細菌種屬之間的交叉反應，如革蘭氏陽性菌包括梭菌屬Clostridium、乳桿菌屬Lactobacillus和鏈球菌屬Streptococcus。當然也需要關注宿主細胞和實驗操作環(huán)境中比較常見的如人源DNA污染類型。

檢測限（Detection Limit）

檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，不需要被準確定量為一個準確值。EP中要求每種支原體每個稀釋濃度都需要有24次檢測數據，可以在不同天做3次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度做8次重復檢測；或者可以選擇不同天做4次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度做6次重復檢測。檢測陽性率需要滿足95%以上可以作為檢測限。

對需要進行檢測限確認的支原體類型，試劑盒廠家需盡可能多的覆蓋法規(guī)藥典中要求的支原體類型，并需要對每種支原體的檢測限進行摸索。而對于生物制品企業(yè)來說，通常需要根據實際使用的原輔料來源進行選擇。另外建議把人源支原體類型考慮進去。

如果在生產過程中使用或接觸禽細胞或材料，應進行滑液囊支原體的檢測限驗證；
如果在生產過程中使用或接觸昆蟲或植物材料，應進行螺原體的檢測限驗證；
豬鼻支原體在支原體污染樣本中占比非常高，受到中國食品藥品檢定研究院的關注。

相比于歐洲藥典，日本藥典中對于需驗證檢測限的支原體中，并未提到雞毒支原體而是增加了唾液支原體。

耐用性（Robustness）

耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗提供依據。對于耐用性的評估，需要關注支原體檢測方法對于檢測試劑中MgCl2、引物和dNTP的濃度變化，核酸提取試劑盒或提取步驟的改變以及使用不同核酸擴增儀的耐受程度。

可比研究（Comparability Study）

如果要使用NAT替代藥典方法，則需要通過對比確認NAT法能夠替代培養(yǎng)法或者指示細胞培養(yǎng)法，通常需要考慮方法的檢測限，同時也需要把專屬性（如覆蓋的支原體范圍以及可能的假陽性）考慮進去。對于檢測限的對比，需滿足“檢測限達到10 CFU/mL，可以替代培養(yǎng)法；檢測限達到100 CFU/mL，可以替代指示細胞培養(yǎng)法”。

進行可比研究有2種可選的方式：

1. 使用相同驗證支原體菌株，同時進行NAT法和藥典方法的同步實驗，確認檢測限；

2. 使用NAT法驗證結果與之前的藥典方法驗證結果進行對比，但對于2種方法中使用的支原體標準品的確認文件需要仔細記錄。
 

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