糖尿病作為全球性的慢性疾病，其患者數(shù)量每年激增，并導致一定死亡率， 多與心血管異常有關，可引發(fā)嚴重肢體缺血和截肢。血管缺陷是由機體現(xiàn)有的血管系統(tǒng)惡化和血管生成障礙共同引起的。血管生成的主要調節(jié)因子之一是缺氧誘導因子（HIFs），其β亞基又稱芳烴受體核轉運子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），與糖尿病的發(fā)展和進展有關。血管生成主要由內皮細胞(ECs)驅動，整體和EC特異性ARNT缺失都與胚胎致死有關。內皮細胞中的ARNT缺失加劇了糖尿病介導的缺血誘導血管生成損傷。在糖尿病背景下，ARNT在內皮中的表達減少，可能解釋了為什么糖尿病是導致血管內皮功能障礙和組織修復以及再生延遲的最大危險因素，并最終表現(xiàn)為嚴重的血管并發(fā)癥。

 

來自美國芝加哥大學研究團隊，對內皮芳烴受體核轉運體（ecARNT）介導2型糖尿病小鼠外周血缺血血管生成反應進行研究，相關研究成果于2021年6月發(fā)表在Frontiers in Cell and Developmental Biology上。這篇文章研究了在2型糖尿病小鼠中， ecARNT的表達下降與血管生成缺陷之間的關系。研究人員采用了一種攜帶可誘導的EC特異性ARNT敲除突變的小鼠模型（Arnt^△EC,ERT2），發(fā)現(xiàn)這種小鼠在非糖尿病和糖尿病條件下都出現(xiàn)了血流恢復受損的情況，但糖尿病動物的損傷程度更大。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，通過siRNA介導的ARNT活性敲低可以減少在高葡萄糖條件下培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中的管狀形成和細胞存活。Arnt^△EC,ERT2突變還降低了小鼠骨骼肌微血管內皮細胞（MVECs）的細胞存活率，同時增加了活性氧（ROS）的產生。當這些細胞在高糖濃度下接受ROS抑制劑處理時，Arnt^△EC,ERT2 MVECs的存活率增加。這表明在高糖條件下，ARNT保護細胞免受ROS產生造成的損傷。

文章中有關細胞存活率統(tǒng)計采用細胞凋亡實驗進行測定，并使用Moxi GO II 快速流式細胞儀(Orflo Technologies)進行測定。實驗方案如下：轉染ARNT-siRNA或對照siRNA后，HUVECs (1.1 × 10⁵)在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中孵育6小時，然后在高糖（HG）或正常葡萄糖（NG）培養(yǎng)基中孵育。使用0.25%胰蛋白酶從皿中收集HUVECs，并使用Moxi GO II 每24小時計數(shù)一次，連續(xù)計數(shù)3天。HG或NG處理48小時后，通過細胞凋亡測定HUVECs和MVECs的細胞存活率。用PBS洗滌細胞，使用Annexin V和PI試劑盒(Orflo Technologies)FITC偶聯(lián)的Annexin V和PI進行雙染色，繼而通過Moxi GO II 進行細胞凋亡檢測。

圖1 在高糖(HG)或正常培養(yǎng)基(NG)條件下，ARNT表達對細胞活力和細胞活性氧(ROS)產生的影響。
(A)如所示，HUVECs中存在HG或NG培養(yǎng)基時，處理組用siRNA轉染誘導ARNT敲低，對照組為control-si。(B)高糖條件下，處理組Arnt^△EC,ERT2 和對照組Arnt^fl/fl WT小鼠分離的MMVECs中ROS水平。(C) Mito-TEMPO抑制ROS對細胞活力的影響。從處理組Arnt^△EC,ERT2 和對照組Arnt^fl/fl WT小鼠中分離的MMVECs在HG培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后給予0.5μM的Mito-TEMPO 24 h。使用Moxi GO II測定細胞活力。數(shù)據(jù)以mean±SEM表示(每組n = 6-8)。*P ＜0.01. (D)內皮細胞ARNT在糖尿病血管生成中的作用示意圖。
 

文章中采用Orflo Technologies公司的Annexin V和PI試劑盒以及Moxi GO II快速流式細胞儀，進行細胞凋亡檢測，區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并定量分析各自所占比例。對誘導的EC特異性ARNT缺失HUVECs以及MVECs的細胞活力進行統(tǒng)計分析。從圖1中可以看出，通過siRNA介導的ARNT活性敲低，能夠降低在高葡萄糖條件下培養(yǎng)的HUVECs管狀結構形成和細胞存活率。Arnt^△EC,ERT2突變會降低MVECs的存活率，同時增加活性氧（ROS）的產生。當這些細胞在高葡萄糖濃度下接受ROS抑制劑處理時，其存活率得到了提高。本研究首次建立了ecARNT與糖尿病血管生成受損之間的聯(lián)系，并證明了在糖尿病中，ecARNT缺乏通過增強ROS的負面作用來加劇血管生成受損的作用機制。

Moxi GO II快速流式細胞儀

傳統(tǒng)流式細胞儀設備體積大，構造復雜，價格昂貴，通常作為平臺產品儀器使用。儀器操作復雜，維護繁瑣，對操作者要求較高，往往需要進行專業(yè)操作培訓，具備專業(yè)知識技術才能使用。同時平臺產品排隊周期長，限制了科研人員的使用。

 

針對這種情況，美國Orflo Technologies公司將行業(yè)公認的細胞計數(shù)和大小測量金標準——庫爾特原理（Coulter Principle）與熒光流式檢測技術相結合，推出的新一代快速流式細胞儀——Moxi GO II，滿足了研究人員對細胞凋亡檢測的需求。

 

美國Orflo Technologies公司是一家非常專業(yè)的細胞分析儀器研發(fā)和制造企業(yè)，擁有多項專利技術，產品以庫爾特原理的高精細胞計數(shù)儀和超快流式細胞儀為主。作為中國地區(qū)獨家代理，環(huán)亞生物科技有限公司全權負責Orflo Technologies產品在中國地區(qū)的推廣、銷售，為廣大用戶提供專業(yè)的技術咨詢和產品服務。

環(huán)亞生物，生命科學產品全國性代理商，不斷把國外頂級的創(chuàng)新產品引入中國。環(huán)亞生物具備完善的公司運營、產品管理、營銷、售前技術支持和售后維修體系。
    
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https://doi.org/10.3389/fcell.2021.691801

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