如何破解細胞大小之謎，一直是生命科學領域的熱門話題。很早就清楚細胞大小源于細胞生長和分裂的頻率平衡，決定了細胞內(nèi)的幾何結構和細胞器大小，并影響細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)和其他分子的方式，進而影響生物合成過程。同時細胞大小結合細胞周期的變化，反映了生物體新陳代謝和對環(huán)境的生理適應的變化。最近，諸多研究者聚焦于細胞大小中細胞質(zhì)量或細胞體積的控制機制研究。細胞體積可通過庫爾特原理或3D顯微鏡進行測量，單個細胞的質(zhì)量定量則是直接記錄浮力或干質(zhì)量（主要由生物合成和降解的總和決定）。如果細胞體積在生長過程中與細胞干質(zhì)量成比例，則細胞質(zhì)量密度保持恒定，可以用細胞干質(zhì)量除以細胞體積來計算。然而細胞的生命活動紛繁復雜，例如生長、分化或衰老，以及細胞類型不同，導致細胞大小和體積的變化，從而引起細胞干質(zhì)量和細胞體積的比例關系隨之改變。因此如何較為穩(wěn)定的實現(xiàn)細胞質(zhì)量密度的測量受到了研究者的關注。

 

最理想的方式是直接、準確地測量細胞的質(zhì)量密度，但是現(xiàn)有的幾種方式皆有局限性，誤差較大。為此，來自哈佛醫(yī)學院的Xili Liu等人開發(fā)了歸一化拉曼成像-Normalized Raman Imaging （NoRI）。NoRI能夠?qū)�活細胞或光學切片固定細胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和水密度進行無標記的直接測量；總質(zhì)量通過細胞體積上的質(zhì)量密度積分，基于z堆疊圖像計算，靈敏度可達15 mg/ml。相關研究以“The uniformity and stability of cellular mass density in mammalian cell culture“為題，發(fā)表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》上。
 

本研究采用三種不同類型的哺乳動物細胞系，HeLa (CCL-2人癌癥細胞系），NIH3T3 (CRL-1658，狗上皮細胞系）和RPE-1 (CRL- 4000)，小鼠纖維細胞系），使用NoRI顯微鏡直接測量細胞中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的質(zhì)量密度，研究質(zhì)量密度如何對細胞外的滲透應激、蛋白質(zhì)合成的抑制、蛋白質(zhì)降解的抑制、細胞骨架破壞和其他生理狀態(tài)變化等各種擾動做出反應。作者將上述三種細胞分別在饑餓培養(yǎng)基（無血清，滲透壓350mOsm）、+200mOsm高滲培養(yǎng)基（總滲透壓542 mOsm）、+400mOsm高滲培養(yǎng)基（總滲透壓742 mOsm）、低滲培養(yǎng)基（滲透壓158mOsm）以及雷帕霉素、環(huán)己酰胺、諾可唑和Ouabain八水合物等藥物中進行處理，處理完成后對細胞的蛋白質(zhì)合成速率、細胞增殖、SAβ-半乳糖苷酶活性和免疫熒光多項指標進行檢測。SE蛋白染色法（固定細胞染色后通過熒光顯微鏡成像）估算細胞的干質(zhì)量，Coulter原理測量細胞體積，NoRI顯微鏡測量細胞中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的質(zhì)量密度以及細胞周期。檢測相關圖像及數(shù)據(jù)均由Matlab（Mathworks）或Image J（National Institute of Health）的自定義設置和分析。

 

文章中對于細胞體積的測量，采用了Orflo Technologies公司提供的Moxi Go II，庫爾特原理的快速流式細胞儀，具體操作：0.05%或0.25%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化細胞， 重懸于相應的藥物或滲透壓DMEM中，然后選擇預設程序“細胞計數(shù)（僅限大�。�”完成細胞體積的測量。在Moxi GOⅡ測量結果中，細胞樣本中的碎片或死細胞可通過設置細胞的直徑門控而排除掉。

部分結果如下：

 

圖1. 在MDCK和HeLa細胞中，細胞大小隨滲透擾動而變化：A，C，在MDCK（A）和HeLa（C）細胞中，通過SE蛋白染色估算的干質(zhì)量變化。B，D，在MDCK（B）或HeLa（D）細胞中，通過庫爾特原理測量的細胞體積變化。在低或+200mOsm高滲培養(yǎng)基中處理1小時或在3μM ouabain中處理5小時后測量細胞。N=8524-16257個細胞（干質(zhì)量），N=3145-8000個細胞（體積）。（A-D）中的紅色虛線表示對照樣品的中位數(shù)。

 

圖2. 細胞骨架擾動增加了HeLa和MDCK細胞中的蛋白質(zhì)密度。細胞在5μM 細胞松弛素D（+CytoD）或5μM諾可唑（+Noco）中處理1小時。A，I，通過SE熒光估算細胞干質(zhì)量。B，J，通過庫爾特原理測量的細胞體積。C，K，通過OPP脈沖標記與SE蛋白質(zhì)染色比率（OPP/SE）定量蛋白質(zhì)合成速率。

研究者通過比較細胞體積、細胞干質(zhì)量和細胞質(zhì)量密度的變化系數(shù)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)密度在不同類型的細胞內(nèi)表現(xiàn)都高度一致。雖然細胞質(zhì)量密度在細胞周期中變化不大，但是和YAP（ Hippo通路中的關鍵轉(zhuǎn)錄輔因子）定位之間存在功能聯(lián)系，又會因外部滲透脅迫、細胞骨架破壞以及細胞的衰老和饑餓等發(fā)生改變。這些差異反應可以幫助我們了解生理和病理條件下細胞大小和質(zhì)量密度調(diào)節(jié)的本質(zhì)。

Moxi GO II
 

Moxi GO II采用庫爾特原理進行細胞計數(shù)和粒徑測量，同時采用488nm激光光源，結合兩個PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根據(jù)需要更換），進行細胞活率、細胞凋亡、轉(zhuǎn)染效率、活性氧簇、線粒體膜電位等常規(guī)流式檢測。儀器設計小巧輕便，無需預熱，開機即用，預設程序，觸屏操控，運行后10秒即可給出測試結果，使用后也無需清潔維護。無論是經(jīng)驗豐富的流式專家，還是初試身手的實驗小白，Moxi Go II都可以助您輕松完成實驗。

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https://doi.org/10.3389/fcell.2022.1017499

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