細胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs) 是活細胞分泌的直徑約30~150 nm的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，因其具備良好的生物相容性、低免疫原性和天然的靶向能力而被視為理想的藥物遞送載體。然而，如何將治療藥物有效裝載至EVs內(nèi)部以及到達受體細胞后如何有效釋放是細胞外囊泡作為治療性載體面臨的首要難題。

目前裝載藥物在EVs內(nèi)部的方法總體可以分為兩大類
01.外部裝載
在分離純化獲得EVs后，通過機械或化學(xué)手段暫時打開EVs的膜，使藥物進入囊泡中；在早期的推文中，小編報道過不同的外部載藥策略及效果的對比（外泌體載藥策略：你選對了嗎？），基于電穿孔、超聲、擠壓、凍融等物理方法進行外源性EVs蛋白裝載，會一定程度上損害EVs的完整性和蛋白質(zhì)的活性，這無疑會影響藥物的載量和遞送效率，同時還會伴隨操作流程復(fù)雜的問題。

02.內(nèi)源表達
通過細胞內(nèi)源表達，使蛋白或RNA等藥物被分選進入EVs。蛋白藥物通常以共價連接的形式結(jié)合在EVs膜上且內(nèi)體逃逸能力低，使得內(nèi)源表達策略用于胞內(nèi)蛋白的遞送充滿挑戰(zhàn)。此前曾有體外實驗報導(dǎo)EVs介導(dǎo)的藥物遞送到達靶細胞的效率不足5%，那么有沒有一種既無損又高效的EVs蛋白負載和靶向的技術(shù)平臺呢？

TOP-EVs
荷蘭烏特勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Lei和Sluijter等多個科研團隊緊密合作，嘗試探索雷帕霉素相互作用的異二聚體蛋白FK506結(jié)合蛋白 (FKBP12) 和T82L突變體FKB12-雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (FRB) 的潛力。FKBP12通過N-肉豆蔻�；�序列連接到細胞膜上，F(xiàn)RB則通過GGSGG接頭與靶蛋白融合，通過在EV表面修飾融合性水皰性口炎病毒糖蛋白 (vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-G) 進一步促進EV在受體細胞中的內(nèi)體逃逸，以提升胞內(nèi)蛋白的遞送。該藥物遞送平臺被命名為TOP-EVs (technology of protein loading through extracellular vesicles, TOP-EVs) , TOP-EVs在體外和體內(nèi)條件下均可有效地介導(dǎo)多種靶蛋白的胞內(nèi)傳遞，有望用于推進蛋白質(zhì)治療藥物的發(fā)展。該成果以題名"TOP-EVs: Technology of Protein delivery through Extracellular Vesicles is a versatile platform for intracellular protein delivery" 發(fā)表在Journal of Controlled Release上。
 

圖1. TOP-EVs技術(shù)平臺示意圖

補充：雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，最早是從復(fù)活節(jié)島土壤中的鏈霉菌中分離出來，被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌作用，之后被發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制功能。FKBP12 (FK506 binding protein 12) 是能與大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結(jié)合，并在哺乳動物中廣泛表達的一類蛋白。

TOP-EVs技術(shù)平臺
為了實現(xiàn)可控同時可逆的蛋白裝載及隨后通過EVs的遞送，作者整合了融合源性VSV-G和雷帕霉素誘導(dǎo)的異源二聚體T82L突變體FRB (DmrC) 與FKBP12 (DmrA) 融合的靶蛋白。選取GFP蛋白作為模型，作者首先構(gòu)建了GFP TOP-EVs穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，將其暴露在雷帕霉素（配體）環(huán)境中，通過共聚焦熒光顯微鏡確認，孵育24 h后GFP已遷移到細胞核外。隨后再探索這個策略能否將GFP有效裝載到EVs中。通過在HEK293FT細胞中瞬轉(zhuǎn)GFP TOP-EV質(zhì)粒，結(jié)合VSV-G共轉(zhuǎn)染構(gòu)建了TOP-EVs細胞系（供體細胞）。隨后加入配體，換成無外泌體培養(yǎng)基，通過差速超速離心的方法分離獲得EV樣品，首先用WB分析定性和（半）定量地驗證GFP蛋白的表達情況（圖2）。

作者設(shè)置了一系列的對照條件（表1）來確認配體和VSV-G是不是TOP-EV平臺實現(xiàn)蛋白裝載和遞送的必要條件。從WB的結(jié)果可以判斷，在不添加VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的情況下，供體細胞與配體共孵育并不會顯著提升GFP的裝載量。然而，當(dāng)供體細胞與VSV-G共轉(zhuǎn)染同時與配體共同孵育時，GFP在EVs的裝載量得到顯著提升。這個結(jié)果提示VSV-G質(zhì)粒和配體都是GFP裝載不可或缺的條件。

表1. TOP-EV平臺不同處理方法（＋表示添加，－表示未添加）
圖2. 通過WB定性和（半）定量驗證GFP的表達情況

NanoFCM研究GFP裝載效率
這些GFP在所有的EVs中是均勻分布的嗎？還是僅在某些EV亞群中過表達？這個問題就需要通過單顆粒的手段來解答了。

作者用納米流式檢測儀進一步考察了TOP-EVs平臺對GFP的裝載效率，如圖3A所示，在未添加VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時，不管是否加入配體，負載GFP的EVs顆粒濃度均較低；添加VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染之后裝載GFP的EVs顆粒濃度明顯升高，配體和VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染同時發(fā)生的情況下GFP裝載效率達到66.2%（表2），這與WB的結(jié)果一致。采用EVs膜染料MemGlow 640對四種條件下獲得的TOP-EVs進行染色，納米流式檢測確認總顆粒濃度和膜染料陽性的顆粒濃度很接近，證明TOP-EVs的純度非常高。GFP陽性群體和GFP-膜染料雙陽群體的濃度幾乎相同，說明選用的膜染料MemGlow 640對EVs的標(biāo)記效率非常高，可以有效標(biāo)記含有膜結(jié)構(gòu)的顆粒。

此外，GFP陽性群體中含四跨膜蛋白 (CD9/63/81) 的TOP-EVs從11.3% (-/+：配體/VSV-G) 提高到18.6% (+/+：配體/VSV-G) ，GFP陽性率顯著高于CD9/63/81的陽性率，表明大部分TOP-EVs是不表達四跨膜蛋白的。從粒徑分布圖中發(fā)現(xiàn)GFP陽性顆粒（綠色）的平均粒徑整體大于GFP陰性顆粒（藍色）的平均粒徑（圖3D），且TOP-EV (+/+：配體/VSV-G) 的GFP陽性率顯著高于TOP-EV (-/+：配體/VSV-G) ，使用納米流式可以快速揭示EVs粒徑大小和功能之間的相互關(guān)系。至此可以得出結(jié)論，VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和配體誘導(dǎo)的相互作用是促進內(nèi)源性TOP-EVs蛋白裝載和傳遞的基本條件。

圖3. 納米流式對不同培養(yǎng)條件下TOP-EVs內(nèi)的GFP裝載情況分析

表2. NanoFCM分析GFP裝載效率

細胞水平驗證TOP-EVs的GFP傳遞效率
本研究中，TOP-EVs是由HEK293FT細胞瞬時轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的，作者設(shè)計了一系列對照實驗，驗證了TOP-EVs傳遞蛋白的能力來源于直接胞內(nèi)蛋白遞送而不是質(zhì)粒污染。作者選用多西環(huán)素 (doxycycline, Dox) 誘導(dǎo)的野生型GFP構(gòu)建體，在Dox存在的情況下，構(gòu)建體中TRE3G反式激活因子的表達可以促進GFP轉(zhuǎn)基因表達。如圖4B所示，作者設(shè)計了16種不同的EVs處理策略，24 h后，熒光顯微鏡下觀察到僅GFP TOP-EVs處理的受體細胞中觀察到GFP的存在，TOP-EV (+/+：配體/VSV-G) 的GFP熒光亮度最強，用Dox培養(yǎng)且由Dox誘導(dǎo)的野生型GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生的EVs處理的受體細胞中未檢測到GFP（圖4C）。這一結(jié)果驗證了作者先前的假設(shè)，即TOP-EVs對胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送的促進作用，并不是由于分離過程中的質(zhì)粒污染或?qū)①|(zhì)粒直接裝載到EVs中導(dǎo)致的。

圖4. 細胞水平驗證TOP-EVs介導(dǎo)的GFP蛋白傳遞有效性

TOP-EVs普適性研究
為了證明TOP-EVs遞送平臺的普適性，作者還拓展了體外條件下TOP-EVs平臺對于Cre重組蛋白酶、CRISPR/Cas9核糖核蛋白復(fù)合物 (RNP) 等靶蛋白的遞送能力，同時驗證配體/VSV-G對TOP-EVs介導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白傳遞的重要性。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)TOP-EVs可以在體內(nèi)成功介導(dǎo)肝臟中的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送。

綜上，研究者開發(fā)了一種在體內(nèi)和體外實現(xiàn)內(nèi)源性蛋白有效裝載和介導(dǎo)各種靶蛋白的功能性胞內(nèi)遞送的多功能平臺，在基因編輯領(lǐng)域也有強大的應(yīng)用潛力

NanoFCM小結(jié)
在該研究中，作者基于納米流式檢測儀卓越的散射光和熒光檢測性能，結(jié)合不同的標(biāo)記策略，建立了單外泌體水平不同類型蛋白 (GFP、四跨膜蛋白(CD9/63/81) )以及膜結(jié)構(gòu)的標(biāo)記、檢測和分析方法，納米流式檢測技術(shù)在整個TOP-EVs平臺的開發(fā)和驗證過程中起到關(guān)鍵的作用。我們期待文章的作者們能夠更進一步，將TOP-EVs平臺拓展到更多類型的蛋白，并向產(chǎn)業(yè)化邁進。