實驗第一步，設(shè)計實驗！
不同的實驗方法需要設(shè)計的實驗分組也是不一樣噠，常見的幾種分組簡單整理如下哦~  


通常情況下，每組實驗至少需要設(shè)置 3-5 個平行，減少實驗誤差。

注意：以上是常規(guī)的分組思路，一些特殊實驗方法可能需要設(shè)置更多的分組 (如 LDH 細胞活力檢測)，實驗開始前詳細閱讀產(chǎn)品說明書或?qū)嶒?Protocol 是一個好習慣哦！

實驗設(shè)計好了，要開始實驗了，檢查一下我們的試劑/儀器準備好了嗎？

• 細胞系、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、抗生素，有條件的小伙伴也可以直接購買完全培養(yǎng)基哦~
• 96 孔板、細胞活力檢測試劑、無菌槍頭、無菌離心管、無菌水、無菌 PBS 等。
• 酶標儀。

一切準備就緒，我們來進行細胞復蘇吧~

 

【細胞復蘇】

取一支凍存細胞，在 37℃ 水浴中快速解凍。迅速轉(zhuǎn)移至 10 mL 完全培養(yǎng)基中，800 rpm 3 min 常溫離心收集細胞，細胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，并置于 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(更多細胞復蘇 tips，請參考往期推文：干貨分享 | 細胞凍存與復蘇避坑指南)
注意: 不同凍存液細胞復蘇可能有差異，還是那句話，實驗開始前要詳細閱讀產(chǎn)品說明書或?qū)嶒?Protocol！
找一個合適的時間，看看我們的細胞是不是乖乖長大了？ 嗯~長得還不錯 ，進行預實驗來判斷一下最佳接種細胞量以及試劑使用量吧~

【對數(shù)期細胞收集】

細胞生長至對數(shù)期時收集細胞，使用細胞計數(shù)板計數(shù)。

【調(diào)整細胞密度】

使用 96 孔板時每孔加入 100 μL 細胞混懸液，設(shè)置 5-7 個細胞密度梯度，每個細胞密度設(shè)置 3-5 個復孔，確定檢測試劑所需最佳細胞密度。

啥都準備好了，廢話不說，我們上實驗！

【正式實驗】：根據(jù)預實驗結(jié)果接種細胞，置于 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

【配制藥物母液】：按照需要的實驗藥物濃度合理配制藥物母液，使用時稀釋母液即可。

【加藥】：每孔加入相同體積不同濃度的藥物，設(shè)置藥物處理時間為 12 h、24 h、36 h、48 h 等。

【檢測】：藥物處理后選擇合適的方法進行細胞活力檢測。


▐  1. CCK-8 檢測
基于 WST-8 檢測細胞增殖和細胞毒性的比色檢測法，主要用于細胞活性檢測。


檢測原理： WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原成 Formazan (橙黃色)。CCK-8 為預混溶液，即開即用。

 具體操作如下：

1） 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；

2） 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1-4 h (避免放在培養(yǎng)箱邊緣位置)；

3） 酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。

圖 1. KN93 和 Gemcitabine 對 CCLP1 細胞活力影響^[1]。

CCK-8 檢測細胞活力發(fā)現(xiàn) KN93 可以增強 Gemcitabine 對 CCLP1 的敏感性。

 

▐  2. Cell-ATP 檢測 

也叫做 CTG 檢測，基于高靈敏度生物發(fā)光檢測技術(shù)，通過對 ATP 進行定量以測定培養(yǎng)物中活細胞數(shù)目及細胞活力。



檢測原理：熒光素酶以熒光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時，可將化學能轉(zhuǎn)化為光能。在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP 在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強度呈線性關(guān)系。此方法不受化合物自發(fā)熒光的影響。

 具體操作如下：

1) 取出細胞培養(yǎng)板，室溫平衡 10 min;

2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 檢測試劑; 

3) 室溫振蕩混勻 2 min，以促進細胞充分裂解; 

4) 室溫孵育 10 min (可根據(jù)預實驗結(jié)果調(diào)整孵育時間)，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定; 

5) 使用具有檢測化學發(fā)光功能的多功能酶標儀進行化學發(fā)光測定 (檢測參數(shù)可根據(jù)儀器類型及檢測靈敏度適當調(diào)整)。

圖 2. SIPL1 對 TNBC 細胞活力的影響^[2]。

CCK-8 (a) 和 CTG 發(fā)光細胞活力測定 (b) 用指示載體轉(zhuǎn)導 BT-549 和 MDA-MB-231 細胞增殖能力的分析。

 

▐  3. LDH 檢測

乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase, LDH) 檢測試劑盒可以在細胞膜完整性喪失進而細胞漿內(nèi)酶釋放時檢測細胞損傷。



檢測原理：在 LDH 的作用下，乳酸被氧化成丙酮酸 (Pyruvate), NADH 和 INT 被硫辛酰胺脫氫酶催化反應(yīng)生成 NAD⁺ 和 Formazan。此方法與 CCK-8 聯(lián)用可以用于死、活細胞的同步檢測。

 具體操作如下：

注意：此方法需要設(shè)置高對照組，即在培養(yǎng)基中加入10 μL Lysis Solution。

• 間接檢測法：

1) 藥物處理細胞后，從 96 孔板每孔吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；

2) 室溫避光孵育 30 min；

3) 每孔加入 50 μL Stop Solution ，酶標儀測定 490 nm 處的吸光度。

• 直接檢測法：

1) 96 孔板每孔吸棄 50 μL 培養(yǎng)基上清，以剩余培養(yǎng)基及細胞作為檢測對象，每孔加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；

2) 室溫避光孵育 30 min；

3) 每孔加入 50 μL Stop Solution，酶標儀測定 490 nm 處的吸光度。

圖 3. OMVs 對 THP-1 細胞活力的影響^[3]。
LDH 檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性 OMVs 不能誘導細胞焦亡及 Caspase-1 的活化。

 在細胞活力檢測實驗中，常見的數(shù)據(jù)分析方法是分析藥物處理前后 OD 值的變化，小 M 也為您整理了幾種方法~

▐  1. 細胞接種有什么要注意的嗎？
細胞接種時需要注意 96 孔板外圈不宜做實驗用途，可以用無菌水填滿，避免培養(yǎng)導致的邊緣效應(yīng)。
▐  2. 對數(shù)期細胞怎么確定？
每種細胞的倍增時間不一樣，在養(yǎng)細胞初期，可以做細胞的生長曲線來確認細胞的倍增時間，根據(jù)細胞倍增時間推測達到對數(shù)生長期的時間。也可以在細胞匯合度達到 80% 左右時收集細胞進行接種。
▐  3. 接種細胞數(shù)量怎么確定？
接種的細胞用于后續(xù)實驗，可根據(jù)藥物培養(yǎng)時間及細胞翻倍速度來確定接種數(shù)量。
▐  4. 每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？
1）當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基或無菌水，不作為測定孔用。

2）有可能會因為 CCK-8 掛壁而產(chǎn)生誤差，建議在加入 CCK-8 后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

3）每孔的細胞數(shù)量過多或過少，請預先在 1,000～100,000 個/孔范圍內(nèi)摸索條件。

▐  5. 哪些物質(zhì)會影響 CCK-8 的測定？
當有還原性物質(zhì)存在時會影響 CCK-8 的測定 (含有維生素 C 的 Glucose 等)。一般培養(yǎng)基中的酚紅或血清不影響測定。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定結(jié)果，扣除空白吸收即可。
▐  6. 在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數(shù)量，如何解決？
可以縮短加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時間。例如：可以把加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間由 2 h 縮短為 1 h。
▐  7. CCK-8 對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？
不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入 CCK-8 培養(yǎng) 1-4 h 吸光度已經(jīng)很高，但懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長孵育時間或增加細胞數(shù)量來解決。

▐  8. 應(yīng)該每次做標準曲線嗎？
雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。
▐  9. CCK-8 能否檢測細菌細胞？
可以檢測 E.coli，但不能檢測酵母細胞。具體操作：向 100 μL E.coli 培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 h 或過夜，再進行吸光度測定。

 

[1] Fu Y, et al. Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 8;9(1):63.

[2] He J, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790. 

[3] Ye X, et al. Peptide MSI-1 inhibited MCR-1 and regulated outer membrane vesicles to combat immune evasion of Escherichia coli. Microb Biotechnol. 2023 Sep;16(9):1755-1773.