DNA甲基化測序后的后期驗證方法介紹
做完測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進行后期驗證，則需要進行下游實驗設計。DNA甲基化研究的后期驗證包括簡單驗證、全基因組甲基化干擾實驗（非靶向）、靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗驗證等。
一、簡單驗證
二、全基因組甲基化干擾實驗（非靶向）
ü DNA甲基化抑制劑
阿扎胞苷（5-Aza）能夠通過與DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共價鍵抑制其酶活性，使細胞的DNA甲基化水平降低。
ü DNA斑點雜交（定性）
ü 比色法（定量）
ü 質(zhì)譜法（定量）
三、靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗驗證
ü CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化實驗：在細胞中人為表達目的基因，或通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修飾。
ü 功能標志物測定
ü ... ...
CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化技術
目標區(qū)域DNA甲基化的驗證手段——Target-BS（靶基因重亞硫酸鹽測序）
典型案例：
Target-BS用于甲基化多位點甲狀腺結(jié)節(jié)診斷
Target-BS發(fā)現(xiàn)食管鱗癌甲基化 biomarker
參考文獻：
① Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)，DOI 10.1186/s13148-017-0430-7
② Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0841
③ Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns，doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z
一、簡單驗證
- 目標基因DNA甲基化的驗證：Target-BS
- 檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
- 檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
二、全基因組甲基化干擾實驗（非靶向）
- DNA甲基化干擾：
ü DNA甲基化抑制劑
阿扎胞苷（5-Aza）能夠通過與DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共價鍵抑制其酶活性，使細胞的DNA甲基化水平降低。
- 檢測整體DNA甲基化變化：
ü DNA斑點雜交（定性）
ü 比色法（定量）
ü 質(zhì)譜法（定量）
- 檢測目標基因的DNA甲基化變化：Target-BS
- 檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
- 檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
三、靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗驗證
- 目的基因DNA甲基化的干擾：
ü CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化實驗：在細胞中人為表達目的基因，或通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修飾。
- 檢測目標基因的DNA甲基化變化：Target-BS
- 檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
- 檢測目標基因蛋白質(zhì)表達水平：Western blot
- 檢測細胞功能受到的影響:
ü 功能標志物測定
ü ... ...
CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化技術
目標區(qū)域DNA甲基化的驗證手段——Target-BS（靶基因重亞硫酸鹽測序）
- 靶向特定區(qū)域進行超高深度甲基化測序。
- 超高深度：可達幾百到幾千乘。
- 單個區(qū)域長度<300bp
- 需要設計BS引物，進行預擴增實驗。
- WGBS vs. TBS相當于RNA-seq vs. RT-qPCR
典型案例：
Target-BS用于甲基化多位點甲狀腺結(jié)節(jié)診斷
Target-BS發(fā)現(xiàn)食管鱗癌甲基化 biomarker
參考文獻：
① Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)，DOI 10.1186/s13148-017-0430-7
② Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0841
③ Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns，doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z
標簽：
DNA甲基化
- 商業(yè)化基因合成的發(fā)展歷程、趨勢和人工智能創(chuàng)新
- RNA-BS揭示NONO蛋白通過調(diào)控mRNA的m5C修飾和可變剪切促進醫(yī)學進展
- WGBS揭示AtSAMS通過DNA甲基化植物花器官發(fā)育的表觀遺傳機制
- 合成生物學：從 ”讀懂生命” 到 “創(chuàng)造生命” 的第三次生物革命
- m5C RNA甲基化測序（m5C MeRIP-seq）技術介紹與應用
- RRBS等分析揭示同卵雙生子與腎小球濾過率相關的DNA甲基化位點
- WGBS+ChIP-seq技術揭示Cdx2轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育與穩(wěn)態(tài)中的動態(tài)結(jié)合機制
- 宏基因組學揭示豬糞與土壤中抗菌藥物抗性基因與金屬抗性基因的共存
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com