共價抑制劑最早可追溯到 17 世紀末的非甾體抗炎藥 Aspirin (阿司匹林)。相較于非共價藥物，共價藥物的優(yōu)勢在于能夠提高藥物效力，延長靶向結(jié)合時間，選擇性更強，同時可以靶向某些“不可成藥” 靶點，解決耐藥性問題。

越來越多的研究表明，許多已上市的藥物都是通過共價作用發(fā)揮其藥效，近年來一些共價蛋白激酶抑制劑的成功上市，如 Ibrutinib  (BTK 共價抑制劑) 和 Dacomitinib  (EGFR 共價抑制劑)，更是讓共價藥物成為了藥物開發(fā)中一個備受關(guān)注的領(lǐng)域[1]。

圖 1. 共價藥物的開發(fā)歷程^[1]。 

在過去的共價藥物的研究歷史中，共價藥物主要是來源自偶然發(fā)現(xiàn)。盡管最早的共價藥物阿司匹林上市于 1899 年，但直到 1971 年阿司匹林的共價作用機制才被揭開。

阿司匹林中的活性成分乙酰水楊酸共價結(jié)合環(huán)氧合酶 (COX-1 和 COX-2)，將其乙�；�轉(zhuǎn)移到 COX 的絲氨酸側(cè)鏈的羥基上，抑制花生四烯酸（環(huán)氧合酶的底物）轉(zhuǎn)化為前列腺素，以發(fā)揮抗炎作用。青霉素類抗生素是另一類共價抑制劑，后面被發(fā)現(xiàn)其機制是基于青霉素 β-內(nèi)酰胺類化合物與青霉素結(jié)合蛋白 1B 的活性位點絲氨酸共價結(jié)合[2]。


圖 2. (a-c) 阿司匹林和 (d-e) 青霉素的共價作用機制圖^[2]。

由此可見，之前的共價藥物都不是刻意設(shè)計的，大多數(shù)來自于天然產(chǎn)物，其共價機制更是在臨床上被廣泛使用后才被闡明。由于共價化合物在過去被認為可能帶來脫靶效應，并且誘發(fā)一些免疫反應從而存在潛在的安全問題，因此當時大多數(shù)醫(yī)藥公司都會優(yōu)先考慮非共價化合物，直到后期越來越多藥物的共價機制被披露，共價化合物才開始被藥物開發(fā)人員重視起來。迄今為止，共價抑制劑更是占據(jù)了上市藥物約 30% 的比例。

傳統(tǒng)的小分子藥物設(shè)計是基于抑制或激活生物靶標的生物活性從而發(fā)揮作用。無論小分子藥物的功能如何，其作用通常取決于活性物質(zhì) (如抑制劑、效應劑或激活劑) 與生物靶標 (如酶、蛋白質(zhì)、離子通道或受體) 之間的相互作用。
 Tips：
共價藥物與靶標發(fā)生共價結(jié)合主要分為兩個過程：(1) 共價藥物的親電彈頭通過靠近生物靶標的活性氨基酸殘基，與生物靶標可逆性結(jié)合。(2) 共價藥物與生物靶標發(fā)生反應以形成共價鍵。

根據(jù)反應的可逆性，共價藥物可以被分為可逆型共價藥物和不可逆型共價藥物。可逆性共價藥物在設(shè)計上旨在提高藥物的安全性和選擇性，而不可逆性共價藥物則提供了更持久的藥理作用，但需要更仔細地考慮其潛在的脫靶效應和毒性風險，建議大家謹慎選擇哦~

丙烯酰胺、β-內(nèi)酰胺等親電彈頭是共價藥物發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，親電彈頭能與靶蛋白中特定的氨基酸殘基 (如半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸等) 發(fā)生化學反應，形成共價鍵，從而抑制靶標蛋白的生物學功能。目前為止，已有幾十種的親電彈頭被發(fā)現(xiàn)，其中在上市和待批準藥物中以“丙烯酰胺類彈頭”開發(fā)的共價藥物數(shù)量最多[3]。

生物靶點的識別和驗證是藥物發(fā)現(xiàn)的第一步，接下來是對鑒定出的苗頭化合物進行表征和結(jié)構(gòu)優(yōu)化。共價藥物發(fā)現(xiàn)中使用的許多方法與傳統(tǒng)藥物化學中使用的方法相似，包括高通量篩選、虛擬篩選和合理的藥物設(shè)計等。然而，在共價藥物的設(shè)計中，很多地方都是獨一無二的 (如靶點選擇、親電彈頭和氨基酸殘基的選擇等)。因此，共價藥物的設(shè)計一般包含四個過程：靶標識別和氨基酸殘基選擇；苗頭化合物的識別；結(jié)合表征；結(jié)構(gòu)優(yōu)化[4]。

圖 3. 共價藥物設(shè)計的階段圖^[4]。 
▐  靶標識別及氨基酸殘基的選擇
治療靶標的識別是共價藥物設(shè)計的第一步，往往基于遺傳學、生物物理學、化學物理學或其他原理的方法進行。通常，疾病靶點應當作為藥物設(shè)計的第一指導原則，在開展藥物開發(fā)工作前，確認疾病-靶點的關(guān)聯(lián)度非常重要。
目前，基于活性的蛋白質(zhì)分析 (Activity-based protein profiling, ABPP) 是用于共價化合物靶點發(fā)現(xiàn)最通用的化學蛋白質(zhì)組學方法之一，通過反應性共價片段來確定共價作用的可能靶點。初步篩選出可能的靶點后，還需要對藥物靶標進行驗證，目的是通過調(diào)節(jié)靶標來驗證其對疾病的治療作用，為靶點的“二次鑒定”提供依據(jù)。

在共價藥物的設(shè)計中，氨基酸殘基的選擇同樣尤為重要。在設(shè)計共價藥物時必須考慮共價彈頭和氨基酸殘基的反應性。此外，還需要考慮該生物靶點是否適合共價機制，以避免潛在的藥物毒性，同時還需要滿足藥物的高選擇性。在各類氨基酸殘基中，半胱氨酸是最為常見的共價氨基酸殘基，其代表藥物有奧美拉唑、氯吡格雷、阿法替尼等[5]。

圖 4. 常見的共價氨基酸殘基結(jié)構(gòu)^[4]。
▐  苗頭化合物的識別
高通量篩選 (High-throughput screen，HTS) 是藥物設(shè)計中常用技術(shù)之一，用于從化合物庫中發(fā)現(xiàn)可能成為藥物化學優(yōu)化的先導化合物，可以加速大批量化合物的篩選進程。對于已知共價抑制劑及具有共價反應基團的活性小分子化合物，可以直接使用 HTS 對其進行藥物篩選。

在共價藥物設(shè)計中，基于片段的藥物發(fā)現(xiàn) (Fragment-based Drug Discovery，F(xiàn)BDD) 是一種較為廣泛應用的方法。FBDD 適用于篩選分子量更小、結(jié)構(gòu)不太復雜的分子，通過篩選出有活性的片段后，將不同片段進行組合延伸以到新的藥物分子。由于片段化合物庫范圍更廣，因此篩選出活性化合物的概率更大。并且片段具有分子量小、無效基團少的特點，后期更有利于進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化[6]。例如 BTK 抑制劑 TAK-020  (一種臨床前候選藥物) 就是基于 FBDD 發(fā)現(xiàn)的[7]。

圖 5. 基于 FBDD 的臨床候選藥物 TAK-020^[7]。

此外，DNA 編碼化合物庫 (DNA Encoded compound Library，DEL) 技術(shù)也是一種共價藥物的篩選方法，與 HTS 和 FBDD 相比，DEL 最顯著的優(yōu)勢在于能夠篩選更大的文庫，可達到千萬甚至數(shù)十億級別的數(shù)量[8]。在 2020 年的疫情期間，Rui Ge 等就基于 DEL 技術(shù)，構(gòu)建了具有 6 億個化學結(jié)構(gòu)的 DNA 編碼文庫，針對冠狀病毒中的半胱氨酸蛋白酶 Mpro 進行了共價抑制劑的篩選[9]。

▐  結(jié)合表征
藥物的表征是藥物發(fā)現(xiàn)過程中的關(guān)鍵步驟，傳統(tǒng)的表征參數(shù)包括解離常數(shù)、IC₅₀、EC₅₀ 等。而共價藥物的主要表征方法有：體外生物活性測定、質(zhì)譜分析、時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (TR-FRET)、表面等離子體共振 (SPR) 技術(shù)等。事實上，表征參數(shù)及表征方法的選擇不能一概而論，需要根據(jù)藥物的本身特性去進行選擇。
▐  結(jié)構(gòu)優(yōu)化
在確定了苗頭化合物后，我們往往需要對化合物的結(jié)構(gòu)進行進一步優(yōu)化，目的是改善其藥物代謝動力學性質(zhì)，增強共價彈頭的選擇性，避免脫靶效應，增強藥物的作用時間等。最終經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，就可以得到先導化合物。 

在過去的十年中，共價藥物在新藥開發(fā)領(lǐng)域取得了顯著進展，這主要得益于對共價作用機制的深入理解以及藥物開發(fā)技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新。為了加速共價藥物領(lǐng)域的發(fā)展，MCE 精心設(shè)計了多種化合物庫，如共價化合物庫、半胱氨酸靶向共價化合物、半胱氨酸靶向片段庫、DNA 編碼化合物庫等。這些化合物庫不僅能夠為共價藥物的開發(fā)提供一定幫助，也是研究共價作用機制的重要工具。

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[2] Ghosh AK, et al. Covalent Inhibition in Drug Discovery. ChemMedChem. 2019 May 6;14(9):889-906. 
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[4] Zheng L, et al. Development of covalent inhibitors: principle, design and application in cancer. MedComm – Oncology. 2023; 2:e56. 
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[6] Bon M, et al. Fragment-based drug discovery-the importance of high-quality molecule libraries. Mol Oncol. 2022;16(21):3761-3777.
[7] Sabat M, et al. Discovery of the Bruton's Tyrosine Kinase Inhibitor Clinical Candidate TAK-020 (S)-5-(1-((1-Acryloylpyrrolidin-3-yl)oxy)isoquinolin-3-yl)-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-one, by Fragment-Based Drug Design. J Med Chem. 2021 Sep 9;64(17):12893-12902. 
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[9] Ge R, et al. Discovery of SARS-CoV-2 main protease covalent inhibitors from a DNA-encoded library selection. SLAS Discov. 2022 Mar;27(2):79-85.