疫苗生產中抗生素殘留的免疫學方法
一、疫苗的規(guī)定分類
疫苗是以病原微生物或其組成成分、代謝產物為起始材料，采用生物技術制備而成，用于預防、治療人類相應疾病的生物制品。疫苗接種人體后可刺激免疫系統(tǒng)產生特異性體液免疫和（或）細胞免疫應答，使人體獲得對相應病原微生物的免疫力。用于傳染病預防的人用疫苗，按其組成成分和生產工藝可分為以下類型。
1. 滅活疫苗：病原微生物經培養(yǎng)、增殖，用物理化學方法滅活以去除其增殖能力后制成的疫苗。例如鉤端螺旋體疫苗、甲型肝炎滅活疫苗等。
2. 減毒活疫苗：采用病原微生物的自然弱毒株或經培養(yǎng)傳代等方法減毒處理后獲得致病力減弱、免疫原性良好的病原微生物減毒株制成的疫苗。例如鉤端螺旋體疫苗、甲型肝炎滅活疫苗等。
3. 亞單位疫苗：病原微生物經培養(yǎng)后，提取、純化其主要保護性抗原成分制成的疫苗。例如A群腦膜炎球菌多糖疫苗、流感亞單位疫苗等。
4. 基因工程重組蛋白疫苗：采用基因重組技術將編碼病原微生物保護性抗原的基因重組到細菌（如大腸埃希菌）、酵母或細胞，經培養(yǎng)、增殖后，提取、純化所表達的保護性抗原制成的疫苗。例如重組乙型肝炎疫苗等。
5. 結合疫苗：由病原微生物的保護性抗原成分與蛋白質載體結合制成的疫苗。例如重組乙型肝炎疫苗等。
6. 聯(lián)合疫苗：由兩個或以上活的、滅活的病原微生物或抗原成分聯(lián)合配制而成的疫苗，用于預防不同病原微生物或同一種病原微生物的不同血清型/株引起的疾病。聯(lián)合疫苗包括多聯(lián)疫苗和多價疫苗。例如吸附百白破聯(lián)合疫苗、麻腮風聯(lián)合減毒活疫苗，23價肺炎球菌多糖疫苗、流感病毒裂解疫苗。
二、疫苗成品的檢測項目
疫苗成品檢測項目一般包括鑒別試驗、理化測定、純度、效力測定、異常毒性檢查、無菌檢查、細菌內毒素檢查、佐劑、抑菌劑及工藝雜質殘留量檢測等。疫苗的工藝雜質主要包括以傳代細胞生產的病毒性疫苗中宿主細胞蛋白質和DNA殘留，以及生產過程中用于培養(yǎng)、滅活、提取和純化等工藝過程的化學、生物原材料殘留物，如牛血清、甲醛和β-丙內酯等滅活劑、抗生素殘留等。對于與疫苗關鍵質量屬性相關的工藝雜質（如細胞基質殘留蛋白質和細胞基質殘留DNA，抗生素、核酸酶、殘余牛血清等），如因產品特性無法在成品中檢測時，應在適當的中間產物（如原液或半成品）取樣檢測，其檢測結果應能準確反映每一成品劑量中的殘留水平。對于一般工藝雜質，如經充分驗證證明生產工藝可對其有效、穩(wěn)定地去除或控制，并持續(xù)達到可接受的水平或殘留水平處于分析方法的檢測限以下，相關殘留物檢測可不列入產品的檢定項目中。
三、生物制品中常用的抗生素
生物制品在菌株構建藥物篩選及生產過程中，為了防止細菌污染等原因，會添加某些種類的抗生素。在預防類生物制品（疫苗）中常添加新霉素、紅霉素、慶大霉素，其中紅霉素可引起耳聾和周圍神經炎，慶大霉素除了引起過敏之外，在臨床上如果用于嬰幼兒，可以造成永久性的神經性耳聾。在治療類生物制品（如重組蛋白、單克隆抗體等）中常添加的氨芐西林、四環(huán)素、卡那霉素等，其中氨芐西林易引發(fā)過敏反應，卡那霉素影響耳蝸神經并具有腎毒性。
國家食品藥品監(jiān)督管理局要求在生物制品生產過程中應盡可能避免使用抗生素，必須使用時，應選擇安全性風險相對較低的抗生素品種，且產品的后續(xù)純化工藝應保證可有效去除制品中的抗生素；如后續(xù)工藝不能有效去除，則不得添加。病毒性疫苗生產中僅允許在細胞制備、細胞增殖過程中使用抗生素。使用抗生素時，成品檢定中應檢測抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限值。嚴禁使用青霉素或其他β-內酰胺類抗生素。目前2020版《中國藥典》收錄了微生物培養(yǎng)法和酶聯(lián)免疫法兩種。2020版《中國藥典》規(guī)定，生產過程中加入抗生素的應進行抗生素殘留量檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429），應不高于50ng/劑。
四、抗生素免疫學檢測方法
免疫學具有高通量、操作簡單、檢測時間短等優(yōu)勢，成為疫苗生產中檢測抗生素殘留的常用手段。檢測方法常用的包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法。
1. 酶聯(lián)免疫吸附法
檢測原理：通�；诟偁幮悦庖邫z測原理，以卡那霉素為例�？敲顾嘏c預包被在板上的卡那霉素蛋白偶聯(lián)物競爭結合有限的抗卡那霉素的抗體，然后加入酶結合物反應，形成酶結合物—抗卡那霉素抗體—卡那霉素蛋白偶聯(lián)物復合物，洗滌除去未結合的反應物，經TMB底物顯色產生藍色產物，加終止液后，產物由藍色轉變?yōu)辄S色，其在450nm下有最大吸收峰。樣本中卡那霉素含量與樣本的吸光度呈負相關。
2. 免疫層析法
檢測原理：以四環(huán)素為例。四環(huán)素快速檢測試紙條應用了競爭抑制免疫層析的原理，樣品中的四環(huán)素在流動的過程中與膠體金標記的特異性四環(huán)素單克隆抗體結合，抑制了抗體和NC膜檢測線上的四環(huán)素-BSA偶聯(lián)物的結合，從而導致檢測線顏色的深淺變化。當樣品中不含有四環(huán)素或濃度低于檢測限時，T線顯色強于C線顯色或與C線顯色一致。當樣品中的四環(huán)素濃度等于或高于檢測限時，T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色。而無論樣品中是否含有四環(huán)素質控線C線都會顯色，以示檢測有效。
疫苗是以病原微生物或其組成成分、代謝產物為起始材料，采用生物技術制備而成，用于預防、治療人類相應疾病的生物制品。疫苗接種人體后可刺激免疫系統(tǒng)產生特異性體液免疫和（或）細胞免疫應答，使人體獲得對相應病原微生物的免疫力。用于傳染病預防的人用疫苗，按其組成成分和生產工藝可分為以下類型。
1. 滅活疫苗：病原微生物經培養(yǎng)、增殖，用物理化學方法滅活以去除其增殖能力后制成的疫苗。例如鉤端螺旋體疫苗、甲型肝炎滅活疫苗等。
2. 減毒活疫苗：采用病原微生物的自然弱毒株或經培養(yǎng)傳代等方法減毒處理后獲得致病力減弱、免疫原性良好的病原微生物減毒株制成的疫苗。例如鉤端螺旋體疫苗、甲型肝炎滅活疫苗等。
3. 亞單位疫苗：病原微生物經培養(yǎng)后，提取、純化其主要保護性抗原成分制成的疫苗。例如A群腦膜炎球菌多糖疫苗、流感亞單位疫苗等。
4. 基因工程重組蛋白疫苗：采用基因重組技術將編碼病原微生物保護性抗原的基因重組到細菌（如大腸埃希菌）、酵母或細胞，經培養(yǎng)、增殖后，提取、純化所表達的保護性抗原制成的疫苗。例如重組乙型肝炎疫苗等。
5. 結合疫苗：由病原微生物的保護性抗原成分與蛋白質載體結合制成的疫苗。例如重組乙型肝炎疫苗等。
6. 聯(lián)合疫苗：由兩個或以上活的、滅活的病原微生物或抗原成分聯(lián)合配制而成的疫苗，用于預防不同病原微生物或同一種病原微生物的不同血清型/株引起的疾病。聯(lián)合疫苗包括多聯(lián)疫苗和多價疫苗。例如吸附百白破聯(lián)合疫苗、麻腮風聯(lián)合減毒活疫苗，23價肺炎球菌多糖疫苗、流感病毒裂解疫苗。
二、疫苗成品的檢測項目
疫苗成品檢測項目一般包括鑒別試驗、理化測定、純度、效力測定、異常毒性檢查、無菌檢查、細菌內毒素檢查、佐劑、抑菌劑及工藝雜質殘留量檢測等。疫苗的工藝雜質主要包括以傳代細胞生產的病毒性疫苗中宿主細胞蛋白質和DNA殘留，以及生產過程中用于培養(yǎng)、滅活、提取和純化等工藝過程的化學、生物原材料殘留物，如牛血清、甲醛和β-丙內酯等滅活劑、抗生素殘留等。對于與疫苗關鍵質量屬性相關的工藝雜質（如細胞基質殘留蛋白質和細胞基質殘留DNA，抗生素、核酸酶、殘余牛血清等），如因產品特性無法在成品中檢測時，應在適當的中間產物（如原液或半成品）取樣檢測，其檢測結果應能準確反映每一成品劑量中的殘留水平。對于一般工藝雜質，如經充分驗證證明生產工藝可對其有效、穩(wěn)定地去除或控制，并持續(xù)達到可接受的水平或殘留水平處于分析方法的檢測限以下，相關殘留物檢測可不列入產品的檢定項目中。
三、生物制品中常用的抗生素
生物制品在菌株構建藥物篩選及生產過程中，為了防止細菌污染等原因，會添加某些種類的抗生素。在預防類生物制品（疫苗）中常添加新霉素、紅霉素、慶大霉素，其中紅霉素可引起耳聾和周圍神經炎，慶大霉素除了引起過敏之外，在臨床上如果用于嬰幼兒，可以造成永久性的神經性耳聾。在治療類生物制品（如重組蛋白、單克隆抗體等）中常添加的氨芐西林、四環(huán)素、卡那霉素等，其中氨芐西林易引發(fā)過敏反應，卡那霉素影響耳蝸神經并具有腎毒性。
國家食品藥品監(jiān)督管理局要求在生物制品生產過程中應盡可能避免使用抗生素，必須使用時，應選擇安全性風險相對較低的抗生素品種，且產品的后續(xù)純化工藝應保證可有效去除制品中的抗生素；如后續(xù)工藝不能有效去除，則不得添加。病毒性疫苗生產中僅允許在細胞制備、細胞增殖過程中使用抗生素。使用抗生素時，成品檢定中應檢測抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限值。嚴禁使用青霉素或其他β-內酰胺類抗生素。目前2020版《中國藥典》收錄了微生物培養(yǎng)法和酶聯(lián)免疫法兩種。2020版《中國藥典》規(guī)定，生產過程中加入抗生素的應進行抗生素殘留量檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429），應不高于50ng/劑。
四、抗生素免疫學檢測方法
免疫學具有高通量、操作簡單、檢測時間短等優(yōu)勢，成為疫苗生產中檢測抗生素殘留的常用手段。檢測方法常用的包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法。
1. 酶聯(lián)免疫吸附法
檢測原理：通�；诟偁幮悦庖邫z測原理，以卡那霉素為例�？敲顾嘏c預包被在板上的卡那霉素蛋白偶聯(lián)物競爭結合有限的抗卡那霉素的抗體，然后加入酶結合物反應，形成酶結合物—抗卡那霉素抗體—卡那霉素蛋白偶聯(lián)物復合物，洗滌除去未結合的反應物，經TMB底物顯色產生藍色產物，加終止液后，產物由藍色轉變?yōu)辄S色，其在450nm下有最大吸收峰。樣本中卡那霉素含量與樣本的吸光度呈負相關。
2. 免疫層析法
檢測原理：以四環(huán)素為例。四環(huán)素快速檢測試紙條應用了競爭抑制免疫層析的原理，樣品中的四環(huán)素在流動的過程中與膠體金標記的特異性四環(huán)素單克隆抗體結合，抑制了抗體和NC膜檢測線上的四環(huán)素-BSA偶聯(lián)物的結合，從而導致檢測線顏色的深淺變化。當樣品中不含有四環(huán)素或濃度低于檢測限時，T線顯色強于C線顯色或與C線顯色一致。當樣品中的四環(huán)素濃度等于或高于檢測限時，T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色。而無論樣品中是否含有四環(huán)素質控線C線都會顯色，以示檢測有效。
