摘要

       本研究旨在利用畢赤酵母表達體系高效純化人胰島新生相關蛋白（INGAP），以探索其在胰島再生和糖尿病治療中的潛在應用。通過構建INGAP基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系，優(yōu)化表達條件，并采用親和層析等方法純化目標蛋白。結果顯示，畢赤酵母體系能高效表達并純化INGAP，為糖尿病治療提供新思路。

引言

       胰島新生相關蛋白（Islet Neogenesis Associated Protein，INGAP）是一種具有促進胰腺導管上皮細胞向胰島分化和再生的蛋白質(zhì)，其在胰島再生和糖尿病治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。INGAP的發(fā)現(xiàn)和研究為糖尿病的治療提供了新的方向，尤其是在胰島移植和再生醫(yī)學領域。然而，INGAP的獲取和純化一直是制約其研究和應用的關鍵因素。

       傳統(tǒng)的INGAP獲取方法主要依賴于從天然組織中提取，這種方法不僅效率低下，而且難以獲得高純度的INGAP。因此，利用基因工程技術構建INGAP的高效表達體系，并實現(xiàn)其純化，對于推動INGAP的研究和應用具有重要意義。

       畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種常用的真核表達系統(tǒng)，具有高效、穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點，被廣泛應用于外源蛋白的表達和純化。畢赤酵母表達體系能夠完成復雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾過程，如糖基化、剪切和磷酸化等，從而確保目標蛋白的生物活性和功能。

       本研究旨在利用畢赤酵母表達體系高效純化INGAP，通過構建INGAP基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系，優(yōu)化表達條件，并采用親和層析等方法純化目標蛋白。期望通過本研究，為INGAP的進一步研究和應用提供有力的技術支持，為糖尿病治療提供新的思路和方法。

一、材料與方法

1. 材料

• 菌株與載體：畢赤酵母GS115菌株，INGAP基因表達載體pPIC9K（含AOX1啟動子和α-factor信號肽序列）。
• 試劑：某試劑公司的YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、甲醇、SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂、G25凝膠過濾柱等。
• 儀器設備：某品牌電泳儀、某品牌離心機、某品牌振蕩培養(yǎng)箱、某品牌分光光度計、威尼德電穿孔儀等。

2. 方法

2.1 畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系的構建

• 將INGAP基因插入到表達載體pPIC9K中，構建INGAP-pPIC9K重組質(zhì)粒。
• 采用電穿孔法將重組質(zhì)粒導入畢赤酵母GS115菌株中，篩選高拷貝陽性克隆。

2.2 表達條件的優(yōu)化

• 將陽性克隆接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
• 轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達到3-6。
• 離心收集菌體，用無菌水洗滌后，重懸于BMMY培養(yǎng)基中，加入甲醇誘導表達。
• 每隔24小時補加甲醇，持續(xù)誘導4天。

2.3 蛋白質(zhì)的純化

• 離心收集誘導表達后的發(fā)酵液上清。
• 采用SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂進行初步純化。
• 收集目的峰后，用G25凝膠過濾柱進行進一步純化。
• 將純化后的INGAP進行SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定。

二、實驗結果

1. 畢赤酵母轉(zhuǎn)化體系的構建

       成功構建了INGAP-pPIC9K重組質(zhì)粒，并通過電穿孔法將其導入畢赤酵母GS115菌株中。經(jīng)過篩選，獲得了高拷貝陽性克隆。

2. 表達條件的優(yōu)化

       在優(yōu)化的表達條件下，畢赤酵母能夠高效表達INGAP。通過甲醇誘導4天后，發(fā)酵液上清中的INGAP濃度達到較高水平。

3. 蛋白質(zhì)的純化

       經(jīng)過SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂和G25凝膠過濾柱的純化，獲得了高純度的INGAP。SDS-PAGE電泳結果顯示，純化后的INGAP分子量與預期相符，且純度較高。Western Blot鑒定結果進一步證實了純化產(chǎn)物的特異性。

三、討論

1. 畢赤酵母表達體系的優(yōu)勢

       畢赤酵母表達體系具有高效、穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點，能夠完成復雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾過程，從而確保目標蛋白的生物活性和功能。在本研究中，畢赤酵母成功表達了INGAP，并實現(xiàn)了其高效純化，為INGAP的進一步研究和應用提供了有力的技術支持。

2. 純化方法的優(yōu)化

       在純化過程中，采用了SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂和G25凝膠過濾柱的組合純化方法。這種方法不僅能夠有效去除雜質(zhì)，提高INGAP的純度，還能夠保持INGAP的生物活性。通過優(yōu)化純化條件，獲得了高純度的INGAP，為后續(xù)研究提供了可靠的實驗材料。

3. INGAP的應用前景

       INGAP作為一種具有促進胰腺導管上皮細胞向胰島分化和再生能力的蛋白質(zhì)，在胰島再生和糖尿病治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。通過畢赤酵母表達體系純化INGAP，為糖尿病治療提供了新的思路和方法。未來，可以進一步探索INGAP在胰島移植、胰島再生以及糖尿病治療中的應用，為糖尿病患者帶來更好的治療效果和生活質(zhì)量。

4. 研究的創(chuàng)新點

       本研究首次利用畢赤酵母表達體系高效純化了INGAP，并優(yōu)化了表達條件和純化方法。通過這種方法，可以獲得高純度、活性穩(wěn)定的INGAP，為INGAP的進一步研究和應用提供了有力的技術支持。此外，本研究還探索了INGAP在糖尿病治療中的潛在應用，為糖尿病治療提供了新的思路和方法。