摘要
本研究旨在探討綠色熒光蛋白（GFP）作為標志基因在快速篩選基因轉(zhuǎn)染陽性細胞中的應用。通過構(gòu)建基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因?qū)�入外周血單個核細胞（PBMC），并利用流式細胞儀檢測基因轉(zhuǎn)移效率。實驗結(jié)果顯示，GFP能有效標記轉(zhuǎn)染陽性細胞，為基因治療中的細胞篩選提供了一種快速、準確的方法。

引言

基因治療作為一種前沿的生物醫(yī)學技術(shù)，為遺傳性疾病和腫瘤性疾病的治療提供了新的希望�；�因轉(zhuǎn)移是基因治療的技術(shù)基礎(chǔ)，而如何高效、準確地篩選基因轉(zhuǎn)染陽性細胞則是基因治療成功與否的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的篩選方法，如基于藥物抗性的篩選，雖然有效，但耗時較長，且可能對細胞產(chǎn)生毒性影響。因此，尋找一種快速、安全的篩選方法顯得尤為重要。

綠色熒光蛋白（GFP）作為一種生物發(fā)光蛋白，能夠在無需額外底物或輔因子的條件下發(fā)出綠色熒光。這一特性使其在生物學研究中得到了廣泛應用，特別是在細胞成像和基因表達監(jiān)測方面。近年來，越來越多的研究開始探索將GFP作為標志基因用于基因轉(zhuǎn)染陽性細胞的篩選。通過構(gòu)建含有GFP基因的載體，并將其導入靶細胞，可以利用GFP發(fā)出的熒光快速識別轉(zhuǎn)染陽性細胞。這種方法不僅操作簡單、耗時短，而且不會對細胞產(chǎn)生毒性影響，因此在基因治療中具有廣闊的應用前景。

本研究旨在探討GFP作為標志基因在快速篩選基因轉(zhuǎn)染陽性細胞中的應用，并構(gòu)建基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因?qū)�入外周血單個核細胞（PBMC）。通過流式細胞儀檢測基因轉(zhuǎn)移效率，評估GFP作為篩選標志的可行性和準確性，為基因治療中的細胞篩選提供一種新的方法。

材料與方法

1. 實驗材料

• 實驗試劑：某品牌DMEM培養(yǎng)基、某品牌胎牛血清（FBS）、某品牌PBS、某品牌胰酶、某品牌逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（含GFP基因、HSV-TK基因和NeoR基因）、某品牌polybrene、某品牌G418、某品牌淋巴細胞分離液等。
• 實驗儀器：某品牌移液器、某品牌二氧化碳培養(yǎng)箱、某品牌倒置熒光顯微鏡、某品牌流式細胞儀、某品牌超凈工作臺、某品牌離心機等。
• 細胞株：外周血單個核細胞（PBMC）。

2. 實驗方法

2.1 PBMC的分離和培養(yǎng)

取健康志愿獻血者外周血58 mL，肝素抗凝。使用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用PBS洗滌2遍后，懸浮于含某濃度FBS、某濃度IL-2、某濃度PHA-P和某濃度CD3 McAb的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO₂的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天。

2.2 病毒上清的制備及其滴度測定

將含GFP基因、HSV-TK基因和NeoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞在含某濃度G418的DMEM中培養(yǎng)至基本成層后，棄去上清，換用無G418的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18~24小時，收集上清即為病毒上清。以NIH3T3細胞株檢測病毒滴度，病毒效價=集落數(shù)×上清稀釋倍數(shù)（CFU/mL）。

2.3 基因轉(zhuǎn)染

取培養(yǎng)35天的PBMC懸浮于含某濃度polybrene和某濃度IL-2的病毒上清中，孵育812小時后，去除病毒上清及polybrene，加入含20 %FBS的新鮮培養(yǎng)液。12天后，重復上述步驟，繼續(xù)與病毒上清孵育。如此反復轉(zhuǎn)染23次，轉(zhuǎn)染病毒滴度與細胞比為10:1。

2.4 倒置顯微鏡觀察

取轉(zhuǎn)染后細胞制成細胞懸液，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。轉(zhuǎn)換熒光光源，觀察GFP發(fā)出的綠色熒光，并計數(shù)熒光細胞數(shù)。

2.5 流式細胞儀分析

取轉(zhuǎn)染細胞，用PE標記的鼠抗人CD3、CD4、CD8和CD19單克隆抗體進行細胞表面抗原標記。參照檢測異硫氰酸熒光素（FITC）的常規(guī)方法（激發(fā)波長475 nm，發(fā)射波長490 nm），調(diào)整流式細胞儀工作條件至GFP（工作電壓525 V）。各管分別獲取10000個細胞數(shù)，測定不同CD抗原細胞基因轉(zhuǎn)移效率。

2.6 PCR檢測外源基因整合

按常規(guī)方法進行轉(zhuǎn)染后PBMC基因組DNA提取，以提取的DNA為模板，用NeoR基因引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察NeoR基因的整合情況。

結(jié)果

1. 病毒上清滴度測定

病毒上清滴度為3.75×10⁶ CFU/mL。

2. PBMC的基因轉(zhuǎn)移

在倒置顯微鏡下觀察，重復轉(zhuǎn)染的PBMC生長良好，膜光滑完整，胞漿豐富，核清晰可見。轉(zhuǎn)換熒光光源后，可見綠色熒光細胞，細胞飽滿。進一步觀察PE標記的鼠抗人CD單克隆抗體標記的轉(zhuǎn)染后細胞，熒光視野下可見由GFP產(chǎn)生的綠色熒光細胞、PE產(chǎn)生的紅色熒光細胞及GFP和PE雙標記細胞。

3. FACS測定不同CD抗原細胞基因轉(zhuǎn)移效率

基因轉(zhuǎn)移效率按實驗組UR測定值-陰性本底UR測定值計算。結(jié)果顯示，不同CD抗原細胞中T淋巴細胞基因轉(zhuǎn)移效率較高，轉(zhuǎn)化T細胞中CD4細胞亞群占較大比例，CD8細胞亞群及單核細胞也有一定的基因轉(zhuǎn)移率，B淋巴細胞基因轉(zhuǎn)移率最低。

4. 外源基因在PBMC基因組的整合

應用PCR對轉(zhuǎn)染的PBMC DNA進行NeoR基因鑒定，結(jié)果可見NeoR基因790 bp的PCR產(chǎn)物電泳帶，表明轉(zhuǎn)染的外周血單個核細胞基因組中有NeoR基因整合。

討論

本研究通過構(gòu)建基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因成功導入外周血單個核細胞（PBMC），并利用流式細胞儀檢測了基因轉(zhuǎn)移效率。實驗結(jié)果顯示，GFP能有效標記轉(zhuǎn)染陽性細胞，且不同CD抗原細胞的基因轉(zhuǎn)移效率存在差異。其中，T淋巴細胞基因轉(zhuǎn)移效率較高，尤其是CD4細胞亞群。這一結(jié)果與之前的研究相符，表明T淋巴細胞在基因治療中可能具有更高的轉(zhuǎn)染效率和表達水平。

此外，本研究還通過PCR檢測了外源基因在PBMC基因組的整合情況。結(jié)果顯示，NeoR基因成功整合到PBMC基因組中，進一步證實了基因轉(zhuǎn)染的成功。這一結(jié)果不僅為GFP作為篩選標志的可行性提供了有力證據(jù)，也為后續(xù)基因治療研究提供了重要的實驗基礎(chǔ)。

在策略上，本研究選擇了逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，主要是因為其具有較高的轉(zhuǎn)染效率和安全性。同時，通過引入GFP作為標志基因，實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)染陽性細胞的快速篩選。這種方法不僅操作簡單、耗時短，而且不會對細胞產(chǎn)生毒性影響，因此在基因治療中具有廣闊的應用前景。

在創(chuàng)新方面，本研究首次將GFP作為標志基因用于外周血單個核細胞的基因轉(zhuǎn)染篩選，并成功構(gòu)建了基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系。這一研究不僅豐富了基因治療中的細胞篩選方法，也為后續(xù)研究提供了新的思路和技術(shù)支持。

在應用前景上，GFP作為標志基因在基因治療中具有廣泛的應用潛力。通過構(gòu)建含有GFP基因的載體，并將其導入靶細胞，可以利用GFP發(fā)出的熒光快速識別轉(zhuǎn)染陽性細胞。這種方法不僅適用于外周血單個核細胞，還可用于其他類型的細胞篩選。此外，隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展，GFP作為標志基因的應用范圍也將進一步擴大。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因?qū)�入外周血單個核細胞，并利用流式細胞儀檢測了基因轉(zhuǎn)移效率。實驗結(jié)果顯示，GFP能有效標記轉(zhuǎn)染陽性細胞，為基因治療中的細胞篩選提供了一種快速、準確的方法。這一研究不僅豐富了基因治療中的細胞篩選方法，也為后續(xù)研究提供了新的思路和技術(shù)支持。未來，隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展，GFP作為標志基因的應用前景將更加廣闊。

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實驗推薦儀器：
威尼德電穿孔儀 GenePulserX2、Gene Pulser 830/630、MINI Pulser 399