針對(duì)SARS-CoV-2變異株核衣殼蛋白的單克隆抗體的開(kāi)發(fā)與表征
Omicron變異株及其亞譜系的出現(xiàn)改變了COVID-19大流行進(jìn)程。盡管毒性有所降低，但其傳播性仍然很高�？焖倏乖瓩z測(cè)（RAT）因操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于SARS-CoV-2感染的簡(jiǎn)易診斷，但隨著核衣殼蛋白（NP）的不斷變異，現(xiàn)有的RAT對(duì)Omicron譜系的敏感性逐漸下降，因此開(kāi)發(fā)出能夠識(shí)別變異毒株NP的抗體對(duì)提升RAT檢測(cè)靈敏性至關(guān)重要。 針對(duì)這一需求，來(lái)自加拿大公共衛(wèi)生部、國(guó)家微生物實(shí)驗(yàn)室的Tom Gräfenhan和Ian Wayne Cheney聯(lián)合發(fā)表題為“Development and characterization of monoclonal antibodies recognizing nucleocapsid protein of multiple SARS-CoV-2 variants”的研究成果，他們鑒定出 7 種對(duì) SARS-CoV-2 變異株和重組核衣殼蛋白（rNP）表現(xiàn)出強(qiáng)烈反應(yīng)性的小鼠單克隆抗體，其中5種抗體對(duì)兩種奧密克戎亞譜系在內(nèi)的變異株（VOCs）具有特異性，值得在診斷檢測(cè)開(kāi)發(fā)中進(jìn)行進(jìn)一步的適用性測(cè)試。該研究中基于質(zhì)譜的抗體序列分析使用PEAKS®️ AB完成。
材料和方法
1、SARS-CoV-2特異mAb雜交瘤的生成與篩選
2、抗體對(duì)多種SARS-CoV-2變體的反應(yīng)性測(cè)試
11個(gè)mAbs均與原始SARS-CoV-2 rNP反應(yīng)，7個(gè)對(duì)部分變體有反應(yīng)，5個(gè)對(duì)P.1反應(yīng)強(qiáng)烈，僅2個(gè)對(duì)B.1.617.2有反應(yīng)（表2）。
表2 rNP和 SARS-CoV-2 變異株單克隆抗體的Western blot實(shí)驗(yàn)
a, marks -, +, ++, +++, and ++++ were based on the band density visualized by experienced technician. -: no band observed. 、b, recombinant nucleocapsid protein of the original strain (Wuhan strain);
c, gamma-irradiated reference strain (hCoV-19/Canada/ON_ON-VIDO-01-2/2020, EPI_ISL_425177);
d, all strains were loaded at 1 × 104 pfu/lane for SDS-PAGE.
3、SARS-CoV-2 NP單抗對(duì)SARS-Cov-1、MERS和HCoV的交叉反應(yīng)性測(cè)試
4、mAbs與SARS-CoV-2核衣殼蛋白的結(jié)合親和力測(cè)定
5、免疫噬斑及Omicron亞譜系結(jié)合力實(shí)驗(yàn)
圖2 免疫噬斑試驗(yàn)
最后，mAbs對(duì)近期流行Omicron亞譜系的結(jié)合親和力驗(yàn)證結(jié)果表示，所選5個(gè)mAbs對(duì)BA.4和BQ.1/BQ.1.1親和力顯著降低，對(duì)JN.1親和力與原始株相近（表4）。
小結(jié)
材料和方法
1、SARS-CoV-2特異mAb雜交瘤的生成與篩選
首先用滅活的SARS-CoV-2免疫小鼠以制備雜交瘤，經(jīng)ELISA、Western Immunoblot等篩選出NP陽(yáng)性克隆，最終保留了11個(gè)亞克隆雜交瘤進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)和純化（表1）。然后基于LC-MS/MS技術(shù)對(duì)純化的mAbs進(jìn)行序列測(cè)定，抗體經(jīng)還原、烷基化、PNGaseF酶切糖等處理后，被分為7等份各自經(jīng)pepsin (pH< 2和pH>2), chymotrypsin, Glu-C, Lys-C, Asp-N 和trypsin酶切后通過(guò)nLC-MS/MS檢測(cè)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)PEAKS®️ AB（Bioinformatics Solutions Inc.）分析，自動(dòng)完成抗體蛋白序列組裝及CDR區(qū)注釋，然后使用IgBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/index.cgi)基于蛋白質(zhì)序列進(jìn)行種系基因比對(duì)和等位基因判定。
2、抗體對(duì)多種SARS-CoV-2變體的反應(yīng)性測(cè)試
11個(gè)mAbs均與原始SARS-CoV-2 rNP反應(yīng)，7個(gè)對(duì)部分變體有反應(yīng)，5個(gè)對(duì)P.1反應(yīng)強(qiáng)烈，僅2個(gè)對(duì)B.1.617.2有反應(yīng)（表2）。
表2 rNP和 SARS-CoV-2 變異株單克隆抗體的Western blot實(shí)驗(yàn)
a, marks -, +, ++, +++, and ++++ were based on the band density visualized by experienced technician. -: no band observed. 、b, recombinant nucleocapsid protein of the original strain (Wuhan strain); c, gamma-irradiated reference strain (hCoV-19/Canada/ON_ON-VIDO-01-2/2020, EPI_ISL_425177);
d, all strains were loaded at 1 × 104 pfu/lane for SDS-PAGE.
3、SARS-CoV-2 NP單抗對(duì)SARS-Cov-1、MERS和HCoV的交叉反應(yīng)性測(cè)試
作者通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)了 11 種單克隆抗體（mAbs）與 4 種常見(jiàn)人類(lèi)冠狀病毒（HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和 HCoV-229E）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒1型（SARS-CoV-1）以及中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS）的重組核衣殼蛋白（rNPs）之間潛在的交叉反應(yīng)性。將未經(jīng)免疫的兔多克隆抗體和針對(duì)無(wú)關(guān)抗原的小鼠單克隆抗體作為陰性對(duì)照，針對(duì)選定rNPs的兔多克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，這些mAbs對(duì)MERS和4種常見(jiàn)人類(lèi)冠狀病毒rNPs無(wú)反應(yīng)，部分對(duì)SARS-CoV-1 rNP有弱反應(yīng)（圖1）。
圖1 SARS-CoV-2抗體對(duì)其他冠狀病毒NP的反應(yīng)性
4、mAbs與SARS-CoV-2核衣殼蛋白的結(jié)合親和力測(cè)定
參與測(cè)試的7種單克隆抗體都與原始毒株以及5種關(guān)切變異株（VOCs）的rNPs表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合力。F461G6和F461G13對(duì)所有變異株的rNPs都有很強(qiáng)的結(jié)合力，其他抗體則結(jié)合力各有差異（表3）。
表3 終點(diǎn)ELISA法檢測(cè)SARS-CoV-2變體rNPs
5、免疫噬斑及Omicron亞譜系結(jié)合力實(shí)驗(yàn)
在免疫噬斑試驗(yàn)中，7種mABs對(duì)SARS-CoV-2變異株表現(xiàn)出不同的反應(yīng)性（圖2）。F457G3、F459G7、F461G6、F461G7和F461G13對(duì)所有測(cè)試的變異株都表現(xiàn)出強(qiáng)烈反應(yīng)，包括參考毒株、關(guān)切變異株B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2，以及奧密克戎B.1.1.529和BA.2。F457G2對(duì)參考毒株和P.1表現(xiàn)出強(qiáng)烈反應(yīng)，但對(duì)大多數(shù)變異株反應(yīng)較弱，對(duì)B.1.617.2（德?tīng)査儺愔辏o(wú)反應(yīng)。相比之下，F(xiàn)457G6對(duì)參考毒株和P.1反應(yīng)較弱，對(duì)其他變異株無(wú)反應(yīng)。
圖2 免疫噬斑試驗(yàn)最后，mAbs對(duì)近期流行Omicron亞譜系的結(jié)合親和力驗(yàn)證結(jié)果表示，所選5個(gè)mAbs對(duì)BA.4和BQ.1/BQ.1.1親和力顯著降低，對(duì)JN.1親和力與原始株相近（表4）。
小結(jié)
Omicron高傳播性仍具有較大的威脅，RAT早期診斷和抗病毒治療意義重大。本研究篩選出5個(gè)對(duì)多種VOCs反應(yīng)強(qiáng)烈、對(duì)常見(jiàn)冠狀病毒等反應(yīng)微弱的mAbs，但不同檢測(cè)方法結(jié)果存在差異，與抗原處理、緩沖液等因素有關(guān)。NP是理想診斷抗原，M蛋白也有潛力。這5個(gè)mAbs還需針對(duì)最新Omicron亞譜系進(jìn)一步測(cè)試。
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