導(dǎo)讀

近年來(lái)，熒光顯微鏡技術(shù)的迅猛發(fā)展極大地改變了生命科學(xué)的研究方式，已經(jīng)成為研究者對(duì)細(xì)胞、組織進(jìn)行成像的重要方法。傳統(tǒng)熒光顯微鏡雖能快速實(shí)現(xiàn)目標(biāo)定位，但存在諸多局限性。在組織內(nèi)微塑料成像方面，其依賴(lài)的熒光標(biāo)記易脫落、熒光強(qiáng)度會(huì)衰減，特異性檢測(cè)難以實(shí)現(xiàn)，且易受組織內(nèi)其他熒光物質(zhì)的干擾，空間分辨率也無(wú)法清晰呈現(xiàn)微塑料的分布和形態(tài)。在植物化學(xué)成像中，熒光標(biāo)記存在標(biāo)記困難、特異性差以及可能干擾細(xì)胞生理過(guò)程等問(wèn)題，同時(shí)，傳統(tǒng)熒光顯微鏡在空間分辨率和化學(xué)信息獲取上能力有限，難以在亞微米尺度上對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行精確成像和分析。這些問(wèn)題嚴(yán)重限制了微塑料在組織內(nèi)行為和植物細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的深入研究。

新一代化學(xué)成像顯微鏡

美國(guó)PSC公司研發(fā)的新一代高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage，為上述問(wèn)題提供了創(chuàng)新性解決方案。mIRage除了兼具傳統(tǒng)熒光顯微鏡的熒光成像功能之外，還采用新型光學(xué)光熱紅外（O-PTIR）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)成像，突破了傳統(tǒng)化學(xué)成像在空間分辨率上的瓶頸，其化學(xué)成像分辨高達(dá)500 nm，可在亞微米尺度上表征細(xì)胞組織內(nèi)的非標(biāo)記目的蛋白或分子。這種直接對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)標(biāo)記化學(xué)成像的能力，有效解決了熒光顯微鏡在化學(xué)成分分析上的不足。在微塑料研究中，即使是粒徑僅為2 μm的微塑料顆粒，mIRage也能對(duì)其進(jìn)行高分辨率的化學(xué)成分分析，獲得清晰的紅外光譜圖，解決了傳統(tǒng)方法無(wú)法分析微小顆粒成分的難題。在植物研究中，mIRage能夠?qū)χ参锛?xì)胞壁中的纖維素、木質(zhì)素等成分進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的化學(xué)成像，清晰呈現(xiàn)其分布情況，為植物代謝組學(xué)研究提供了有力支撐。

高分辨化學(xué)成像顯微鏡——mIRage

mIRage的特有優(yōu)勢(shì)：
• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼成像（~500 nm）；
• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；
• 非接觸測(cè)量模式—使用簡(jiǎn)單快捷，無(wú)交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；
• 很少或無(wú)需樣品制備過(guò)程(無(wú)需薄片), 可測(cè)試厚樣品；
• 可透射模式下觀(guān)察溶液中的樣品；
• 實(shí)現(xiàn)同時(shí)同地相同分辨率的IR和Raman測(cè)試；
• 熒光顯微成像實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記樣品快速定位。

作為美國(guó)PSC公司在中國(guó)的獨(dú)家代理，Quantum Design中國(guó)于2020年將高分辨化學(xué)成像顯微鏡—mIRage系統(tǒng)引入國(guó)內(nèi)，助力科研工作者在多個(gè)研究方向取了眾多突破性成果，以下將針對(duì)組織內(nèi)微塑料等領(lǐng)域的成果，展示mIRage的超卓性能和先進(jìn)技術(shù)。

一、助力組織內(nèi)微塑料的成像與分析

中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心的科研團(tuán)隊(duì)利用光學(xué)光熱紅外技術(shù)（O-PTIR），以聚乙烯納米塑料（PE-NPs）為研究對(duì)象，深入剖析了小鼠模型中PE-NPs的分布和影響。該研究聚焦于父代暴露于PE-NPs對(duì)自身及其后代生殖健康的潛在影響，以及腸道微生物群和微RNA（miRNA）在這一過(guò)程中的作用機(jī)制。研究成果以“MicroRNA and Gut Microbiota Alter Intergenerational Effects of Paternal Exposure to Polyethylene Nanoplastics”為題發(fā)表于《ACS Nano》（影響因子15.8）上。

科研人員利用光學(xué)光熱紅外技術(shù)（O-PTIR），成功檢測(cè)了聚乙烯納米塑料（PE-NPs）在小鼠血清和睪丸組織中的分布情況。該技術(shù)通過(guò)檢測(cè)樣品因紅外吸收產(chǎn)生的光熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了亞微米級(jí)別的高分辨率成像，能夠精確定位PE-NPs的存在。其非接觸式的檢測(cè)方式，避免了對(duì)生物組織的損傷，尤其適用于復(fù)雜生物樣品的分析。

如上圖所示，研究人員借助O-PTIR技術(shù)對(duì)檢測(cè)到的聚乙烯特定振動(dòng)頻率（2917.33, 2848.55, 1462.04, 和 1118.71 cm⁻¹）的成像，揭示了PE-NPs在F1代雄性小鼠睪丸組織中的分布特征，為深入理解PE-NPs對(duì)生殖健康的潛在影響提供了重要證據(jù)，證實(shí)了父代暴露于PE-NPs不僅影響自身健康，還可能通過(guò)跨代效應(yīng)影響后代的生殖健康。

二、助力植物的化學(xué)成像

法國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)食品與環(huán)境研究院（INRAE）的Nicolas Reynoud研究團(tuán)隊(duì)利用高分辨化學(xué)成像顯微鏡mIRage，結(jié)合原子力顯微鏡（AFM）和拉曼光譜技術(shù)，對(duì)番茄果實(shí)表皮的角質(zhì)層在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的微觀(guān)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了多模態(tài)成像研究。研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)層的力學(xué)性質(zhì)在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出顯著的空間和時(shí)間異質(zhì)性，包括深度方向的力學(xué)梯度和“柔軟”的中央凹槽。這些力學(xué)性質(zhì)的變化與角質(zhì)層的化學(xué)和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性密切相關(guān)。該成果以“Cuticle architecture and mechanical properties: a functional relationship delineated through correlated multimodal imaging”為題發(fā)表于《New Phytologist》（影響因子10.3）上。

如下圖所示，通過(guò)O-PTIR技術(shù)，研究者觀(guān)察到角質(zhì)層中脂質(zhì)、多糖和酚類(lèi)化合物的空間異質(zhì)性。在角質(zhì)層深度方向，從表皮細(xì)胞表面到角質(zhì)層表面，cutin/多糖比例呈現(xiàn)梯度變化，cutin含量逐漸增加。在果實(shí)發(fā)育的后期（40天后），角質(zhì)層中酚類(lèi)化合物（如p-香豆酸和黃酮類(lèi)）積累增多，且主要分布于角質(zhì)層的特定區(qū)域。通過(guò)將O-PTIR成像數(shù)據(jù)與AFM測(cè)得的彈性模量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)晶纖維素和果膠的拉曼強(qiáng)度與彈性模量呈正相關(guān)，而脂質(zhì)和p-香豆酸的拉曼強(qiáng)度與彈性模量呈負(fù)相關(guān)。在角質(zhì)層中央凹槽區(qū)域，O-PTIR成像顯示其化學(xué)成分與周?chē)鷧^(qū)域存在差異，這可能與該區(qū)域較低的彈性模量有關(guān)。

通過(guò)使用mIRage顯微鏡進(jìn)行的O-PTIR技術(shù)，研究者揭示了番茄果實(shí)角質(zhì)層在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中化學(xué)成分的深度分布和變化，明確了這些化學(xué)異質(zhì)性與角質(zhì)層的納米力學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，為理解植物角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系提供了新的視角，也為仿生材料的設(shè)計(jì)奠定了理論基礎(chǔ)。

三、助力藥學(xué)研究:開(kāi)發(fā)新型納米無(wú)定形載藥顆粒

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了基于益生元的阿托伐他�。ˋT）納米無(wú)定形載藥顆粒（PANA）。該團(tuán)隊(duì)借助mIRage成功實(shí)現(xiàn)對(duì)該載藥顆粒的原位成分分析。該結(jié)果以"Prebiotic-Based Nanoamorphous Atorvastatin Attenuates Nonalcoholic Fatty Liver Disease by Retrieving Gut and Liver Health"為名發(fā)表于Small Structures（影響因子13.9）上。

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，脂質(zhì)代謝紊亂引起的脂毒性是主要危險(xiǎn)因素之一。阿托伐他汀 (AT) 雖為廣泛使用的降脂藥物，但存在腸道吸收率低、破壞腸道菌群等問(wèn)題。研究者構(gòu)建的PANA載藥顆粒在肝臟組織中藥物積累效果更佳，且能有效恢復(fù)腸道健康，重建腸道菌群，改善腸道免疫力、屏障完整性并減輕炎癥。

如上圖所示，該研究團(tuán)隊(duì)使用mIRage對(duì)PANA的化學(xué)成分與空間分布進(jìn)行了鑒定。通過(guò)分析菊粉（益生元主要成分）、AT、PANA的紅外光譜，發(fā)現(xiàn)AT 和菊粉在顆粒中均勻混合。PANA中隨機(jī)選擇的樣品的紅外拉曼光譜如圖C（左）所示。AT中1,523 cm^-1處的羰基吸收在菊粉樣品中沒(méi)有信號(hào)為AT的特征峰（菊粉無(wú)此吸收峰）。按照 1,523 cm^-1（綠色）和 1,036 cm^-1（紅色）的映射，活性 AT 和益生元基質(zhì)的圖像在掃描區(qū)域（黃色）顯示出相同的分布。此外，在 PANA 顆粒中可以觀(guān)察到 AT 在 1,580 cm^-1的苯吸收、1,457 cm^-1的強(qiáng) C-C 吸收和菊粉在 1,164 cm^-1 的 C-O 拉伸。以上數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)了活性藥物在益生元基質(zhì)中的封裝和相對(duì)均勻的分布。

這項(xiàng)研究使用mIRage對(duì)載藥顆粒進(jìn)行了化學(xué)顯微成像，準(zhǔn)確表明不同化學(xué)成像在藥物顆粒內(nèi)的空間分布，為制藥工程探索藥物成分的空間分布提供了化學(xué)顯微成像利器。

除了上述應(yīng)用外，mIRage這一熒光、紅外、拉曼三合一的化學(xué)成像顯微還在多個(gè)科研領(lǐng)域有所應(yīng)用：

1.  環(huán)境微塑料

微塑料顆粒（~600 nm）的O-PTIR光譜及成像分析
(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)

2. 高分子材料

1210 cm^-1處采集的PP/PTFE的O-PTIR光譜和顯微圖像
(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)

3. 半導(dǎo)體

薄膜晶體管顯示器中污染物的O-PTIR分析

器件表面缺陷的紅外和拉曼光譜同步（同時(shí)間、同位置）分析
(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)

4. 生命科學(xué)

腦組織的明場(chǎng)顯微圖像、O-PTIR光譜及成像分析

5. 文物鑒定

柯羅19世紀(jì)繪畫(huà)作品中鋅皂異質(zhì)性的O-PTIR顯微光譜及成像分析
(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)

mIRage國(guó)內(nèi)部分發(fā)表文章一覽

☛ 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)借助mIRage成功實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

☛ 中科院過(guò)程工程研究所使用mIRage對(duì)利拉魯肽微球的藥物與載藥顆粒的化學(xué)成分與空間分布進(jìn)行了鑒定，該成果發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces上。

相關(guān)產(chǎn)品
1、非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)—mIRage（生物領(lǐng)域）
2、超高分辨活細(xì)胞熒光紅外顯微成像系統(tǒng)