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宏基因組學(xué)揭示豬糞與土壤中抗菌藥物抗性基因與金屬抗性基因的共存

瀏覽次數(shù):149 發(fā)布日期:2025-3-18  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
抗菌藥物被廣泛用于治療人類和動(dòng)物的感染性疾病,但其過(guò)度使用導(dǎo)致了抗菌藥物抗性(AMR)增加。細(xì)菌對(duì)幾乎所有類別的抗菌藥物都已表現(xiàn)出抗性,這引起了全球關(guān)注?咕幬锟剐詫(duì)公共健康構(gòu)成全球性挑戰(zhàn),而動(dòng)物飼料中添加的鋅(Zn)、銅(Cu)等金屬和環(huán)境中金屬離子的存在可能通過(guò)共選擇機(jī)制促進(jìn)抗菌藥物抗性的傳播。金屬污染可能作為選擇因子促進(jìn)抗菌藥物抗性的傳播,尤其是在金屬和抗菌藥物負(fù)擔(dān)較高的環(huán)境中,抗菌藥物抗性基因(ARGs)和金屬抗性基因(MRGs)的共選擇已被證實(shí)。但共選擇程度尚未完全明確。
 
近日,江蘇省疾病預(yù)防控制中心彭世富博士為第一作者、丁震教授為通訊作者研究了豬糞便和施用污泥的農(nóng)業(yè)土壤中ARGs基因和MRGs基因的共存現(xiàn)象,以及這些抗性基因與可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)之間的關(guān)系。相關(guān)研究成果以《Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry》為題發(fā)表于《Science of The Total Environment》期刊。



標(biāo)題:Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry(豬糞便和施肥農(nóng)田中抗菌和金屬抗性基因的共存)
發(fā)表期刊:Science of The Total Environment
影響因子: IF 8.2 / Q1
技術(shù)平臺(tái):宏基因組測(cè)序

本研究采用宏基因組學(xué)方法對(duì)豬糞便、土壤和沉積物樣本中的抗菌藥物抗性基因(ARGs)、金屬抗性基因(MRGs)以及可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)進(jìn)行分析,MGEs元件被認(rèn)為是ARGs和MRGs傳播的潛在載體。同時(shí)研究檢測(cè)了金屬離子的濃度,以評(píng)估ARGs、MRGs與金屬濃度之間的相互關(guān)系。研究樣本包括來(lái)自中國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)的新鮮豬糞便、施用處理后污泥的土壤以及排放處理后污泥的水體沉積物。在所有三種樣本類型中,四環(huán)素抗性基因和鋅抗性基因是最常被檢測(cè)到的ARGs和MRGs。通過(guò)皮爾遜相關(guān)性分析表明,ARGs與MRGs的豐度之間、ARGs/MRGs與MGEs之間以及金屬與ARGs/MGEs之間存在顯著的相關(guān)性。進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)分析揭示了特定ARGs與MRGs之間、ARGs/MRGs與MGEs之間以及特定金屬(Zn、Cr和Mn)與ARGs和MGEs之間的顯著共存關(guān)系?傮w而言,本研究結(jié)果表明,在養(yǎng)豬場(chǎng)的污泥及其周邊環(huán)境中,抗菌藥物抗性基因和金屬抗性基因存在高度共存現(xiàn)象。研究結(jié)果提示,飼料中添加的金屬可能促進(jìn)了養(yǎng)豬生產(chǎn)環(huán)境中ARGs和MGEs的共選擇,從而導(dǎo)致可移動(dòng)ARGs庫(kù)擴(kuò)大。

研究摘要
 
研究方法
樣本采集:研究選擇了中國(guó)江蘇省的兩個(gè)有使用氧化鋅歷史的豬場(chǎng),采集了新鮮豬糞便、施用處理后污泥的土壤和排放處理后污泥的水體沉積物樣本。
金屬和抗菌藥物殘留檢測(cè):通過(guò)ICP-OES和HPLC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)了樣本中的10種重金屬和15種獸用抗菌藥物的濃度。
宏基因組測(cè)序分析:提取樣本中的總基因組DNA進(jìn)行宏基因組高通量測(cè)序,并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、組裝和開放閱讀框(ORF)預(yù)測(cè),并基于CARD、BacMet等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ARGs和MRGs進(jìn)行注釋,同時(shí)分析了樣本中的MGEs。

研究結(jié)果
(1)糞便、沉積物和土壤中的微生物組特征
豬糞便樣本中的主要菌屬為鏈球菌、擬桿菌、梭菌等,而沉積物和土壤樣本中的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為硫桿菌和 Bradyrhizobium。PCA分析顯示,三種樣本類型的微生物群落組成差異顯著。

圖1:新鮮糞便、沉積物和土壤中細(xì)菌群落的組成和多樣性。
(A)細(xì)菌群落中主要屬(平均相對(duì)豐度超過(guò).1%)的分布。
(B)基于宏基因組的30個(gè)細(xì)菌群落的主成分分析(PCA)。不同顏色表示三種不同的棲息地狀態(tài)。
(C)α多樣性表明,與沉積物和土壤相比,新鮮糞便樣本中細(xì)菌的多樣性更高。
(D)β多樣性顯示,在相同類型的棲息地中,較低的值(由較淺的顏色表示)出現(xiàn)。FA1-5、SA1-5和SMA1-5分別對(duì)應(yīng)A農(nóng)場(chǎng)的新鮮糞便、土壤和沉積物;同樣,F(xiàn)B1-5、SB1-5和SMB1-5分別對(duì)應(yīng)B農(nóng)場(chǎng)的新鮮糞便、土壤和沉積物。
 
(2)新鮮糞便、沉積物和土壤中抗菌藥物及抗菌藥物抗性基因(ARGs)的分布情況
檢測(cè)到的抗菌藥物包括喹諾酮類、四環(huán)素類和簡(jiǎn)單β-內(nèi)酰胺類。ARGs中,四環(huán)素抗性基因在所有樣本中占比最高,表明四環(huán)素的使用可能對(duì)ARGs的分布有顯著影響。
圖2:新鮮糞便、沉積物和土壤中抗菌藥物抗性基因(ARGs)和金屬抗性基因(MRGs)的分布特征。
(A)檢測(cè)到的ARGs的相對(duì)豐度,按其對(duì)應(yīng)的抗菌藥物類別進(jìn)行分類。
(B)ARGs的不同抗性機(jī)制。
(C)檢測(cè)到的MRGs的相對(duì)豐度,按其對(duì)應(yīng)的重金屬及相關(guān)化合物分類。
 
(3)ARGs、MRGs、MGEs和金屬之間的共存模式
通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),鋅濃度與多藥抗性基因(如mdtB和yegN)在糞便中表現(xiàn)出共存關(guān)系,鉻與整合酶基因intI1共存,表明金屬可能通過(guò)共選擇機(jī)制促進(jìn)ARGs和MGEs的傳播。
圖3:在新鮮糞便(A)、沉積物(B)和土壤(C)中,抗菌藥物抗性基因(ARGs)、金屬抗性基因(MRGs)、可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)和金屬之間的網(wǎng)絡(luò)分析。圖表特別繪制以突出顯示與不同金屬實(shí)際相關(guān)的ARGs、MGEs和MRGs。一條連接線表示極其強(qiáng)的(皮爾遜相關(guān)系數(shù)r>0.9)且顯著(P<0.001)相關(guān)性。不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表抗菌藥物抗性基因(ARGs,紅色)、金屬抗性基因(MRGs,粉色)、可移動(dòng)遺傳元件(MGEs,綠色)和金屬(藍(lán)色)。節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)之間的連接數(shù)量成正比。藍(lán)色線條表示與金屬相關(guān)的因素。
 
易小結(jié)
本研究通過(guò)宏基因組學(xué)分析表明,在豬場(chǎng)及其周邊環(huán)境中,抗菌藥物抗性基因和金屬抗性基因存在高度共存現(xiàn)象。金屬的添加可能促進(jìn)了ARGs和MGEs的共選擇,從而導(dǎo)致環(huán)境中可移動(dòng)ARGs的增加。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了金屬在抗菌藥物抗性傳播中的潛在作用,并提示需要關(guān)注動(dòng)物飼料中金屬添加劑的使用。

宏基因組測(cè)序在本研究中的作用

全面分析抗性基因譜:宏基因組測(cè)序能夠全面檢測(cè)樣本中的ARGs和MRGs,揭示了不同生態(tài)系統(tǒng)中抗性基因的多樣性、豐度和分布特征。與傳統(tǒng)的qPCR等方法相比,宏基因組測(cè)序能夠提供更全面的抗性基因譜,包括尚未被注釋的新型抗性基因。

揭示微生物群落結(jié)構(gòu):通過(guò)分析樣本中的微生物群落組成,宏基因組測(cè)序揭示了豬糞便、土壤和沉積物中微生物群落的差異,為理解抗性基因的宿主背景提供了重要信息。

探索基因共存模式:宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)支持了網(wǎng)絡(luò)分析,揭示了ARGs、MRGs和MGEs之間的共存關(guān)系,以及它們與金屬濃度的關(guān)聯(lián)。這種分析有助于理解抗性基因在環(huán)境中的傳播機(jī)制和共選擇機(jī)制。

提供定量和定性信息:宏基因組測(cè)序不僅能夠定性檢測(cè)抗性基因的存在,還能通過(guò)reads比對(duì)提供抗性基因的相對(duì)豐度信息,為評(píng)估抗性基因的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供了定量依據(jù)。

揭示潛在的水平基因轉(zhuǎn)移事件:通過(guò)檢測(cè)MGEs與ARGs和MRGs的共存關(guān)系,宏基因組測(cè)序?yàn)檠芯靠剐曰虻乃睫D(zhuǎn)移提供了線索,有助于理解抗性基因在不同微生物之間的傳播路徑。
總之,宏基因組測(cè)序在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,為深入理解抗菌藥物抗性和金屬抗性基因的共存、共選擇機(jī)制以及它們?cè)诃h(huán)境中的傳播提供了全面且深入的視角。


關(guān)于宏基因組學(xué)測(cè)序研究方案
由于擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)關(guān)注的是目標(biāo)基因的若干區(qū)域,因此其分辨率有限,一般認(rèn)為較為準(zhǔn)確的分類水平到屬級(jí)別。雖然擴(kuò)增子測(cè)序也可以通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)映射預(yù)測(cè)群落可能的功能網(wǎng)絡(luò),但是微生物遺傳片段交流比較頻繁,功能基因的橫向轉(zhuǎn)移也較為普遍,依托于有限菌株建立的功能映射無(wú)法盡可能的還原群落的真實(shí)功能網(wǎng)絡(luò)。全宏基因組測(cè)序技術(shù)直接對(duì)提取的全宏基因組DNA建立隨機(jī)小片段文庫(kù),能夠獲取更多的序列信息。通過(guò)組裝、ORFs預(yù)測(cè)與注釋,可以大大提高分類水平部分至菌株級(jí)別,并通過(guò)各種大型公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相應(yīng)功能注釋,盡可能真實(shí)的獲取群落功能網(wǎng)絡(luò)信息。高精度的分析結(jié)果也使相關(guān)動(dòng)物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)更加具備可行性。
技術(shù)優(yōu)勢(shì):
  1. 超深度視野: 提取的全宏基因組DNA建立隨機(jī)小片段文庫(kù),避免了目的片段的PCR過(guò)程,降低bias,隨機(jī)測(cè)序,獲取更豐富的序列信息;
  2. 更精確分類定位: 最大限度地獲取全宏基因組序列信息,通過(guò)組裝延伸,可精確定位部分序列至分類學(xué)菌株水平;
  3. 真實(shí)可靠的功能分析: 不再是依托映射數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能預(yù)測(cè),而是通過(guò)測(cè)得的功能基因序列盡可能真實(shí)還原構(gòu)建微生態(tài)系統(tǒng)的功能網(wǎng)絡(luò)。

參考文獻(xiàn):
Peng S, Zheng H, Herrero-Fresno A, Olsen JE, Dalsgaard A, Ding Z. Co-occurrence of antimicrobial and metal resistance genes in pig feces and agricultural fields fertilized with slurry. Sci Total Environ. 2021 Oct 20;792:148259. pii: S0048-9697(21)03330-1. doi: 10.1016/j.scitotenv.2021.148259. PubMed PMID: 34147788.
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標(biāo)簽: 宏基因組
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