快速集成總膳食纖維檢測試劑盒使用說明書
快速全組分總膳食纖維檢測程序（包括抗性淀粉和不可消化的寡糖）K-RINTDF （100次/盒）
AOAC方法2017.16 國際谷物科技協會標準草案185
AOAC方法2017.16 國際谷物科技協會標準草案185
產品簡介：
國際食品法典委員會（CAC）于 2009 年 6 月 1通過的膳食纖維定義包括不會被人類小腸中的內源酶水解的碳水化合物聚合物，因此也包括抗性淀粉（RS）。
這一定義還包括聚合度為 3~9 的寡糖，但是否將這些寡糖納入膳食纖維測定值由每個國家當局決定。
2007 年發(fā)布了一種為支持國際食品法典委員會定義而設計的方法 2，成功通過實驗室間評估 3,4，并獲得美國官定分析化學家協會（AOAC）批準（方法編號為 2009.01；2011.25）3-5。AOAC 方法 2009.01 可測定總膳食纖維，所測膳食纖維類型包括高分子量膳食纖維（HMWDF）（不溶性膳食纖維（IDF）和不溶于78%乙醇溶液的、可沉淀的可溶性膳食纖維（SDFP））與可溶于 78%乙醇溶液的、不可沉淀的可溶性膳食纖維（SDFS）。在過去 8 年里，這一方法被廣泛應用于食品和原料檢測，并揭示了其面臨的諸多挑戰(zhàn)/問題：
a) 胰 α-淀粉酶+淀粉葡萄糖苷酶（PAA+AMG）孵育時間長達 16 小時（與用于測定抗性淀粉的 AOAC 方法 2002.02 的孵育條件一致））4,6，沒有生理學依據。食物在小腸中的停留時間一般只有 3 至 5 小時 7-9。
b) 市面上出售的大多數低聚果糖（FOS）中都含有菊三糖（果糖基-β-（2-1）-果糖基-β-（2-1）-果糖），其會隨二糖組分一起被洗脫，無法被 WatersSugar-Pak®高效液相色譜柱測定為膳食纖維。
c) 在 AOAC 方法 2009.01 的孵育條件下，非抗性淀粉水解時會有抗性麥芽糊精生成，被誤測為膳食纖維 8,10,11。
d) PAA/AMG 孵育時間過長，造成樣品過度水解，導致磷酸酯交聯淀粉（RS4，例Fibersym®）12測定結果低于實際值。
e) 出于對檢測人員健康的考慮，不宜使用防腐劑疊氮化鈉。
在下圖（圖 1）介紹的“快速”全組分總膳食纖維檢測（RINTDF）流程中，AOAC 方法 2009.01 和 2011.25 面臨的各項挑戰(zhàn)和局限性都已得到解決 8。使用更高濃度的 PAA 和 AMG 進行孵育可防止抗性麥芽糊精的生成（圖 2）�？s短孵育時間，與生理條件一致，可提高 Fibersym®（RS4）和 Hylon VII®（高直鏈玉米淀粉）的膳食纖維測定值（表 1）。用 TOSOH TSKgel®G2500PWXL 凝膠滲透色譜柱 13替換 Waters Sugar-Pak®色譜柱解決了 F3 色譜分析的問題（圖 3）。縮短孵育時間后，無需在孵育緩沖液中添加疊氮化鈉。此外，RINTDF 使用更高濃度的 PAA 和 AMG 進行孵育，除低聚異麥芽糖之外，所有不可消化的寡糖的 SDFS 測定值與 AOAC 方法 2009.01 測得的結果相同（表 2）。用試管中的樹脂對樣品中的大部分鹽分進行脫鹽處理，然后使用 Bio-Rad 的 HPLC 去離子預柱實現完全去離子，HPLC 的樣品制備也得以簡化。
在下圖（圖 1）介紹的“快速”全組分總膳食纖維檢測（RINTDF）流程中，AOAC 方法 2009.01 和 2011.25 面臨的各項挑戰(zhàn)和局限性都已得到解決 8。使用更高濃度的 PAA 和 AMG 進行孵育可防止抗性麥芽糊精的生成（圖 2）�？s短孵育時間，與生理條件一致，可提高 Fibersym®（RS4）和 Hylon VII®（高直鏈玉米淀粉）的膳食纖維測定值（表 1）。用 TOSOH TSKgel®G2500PWXL 凝膠滲透色譜柱 13替換 Waters Sugar-Pak®色譜柱解決了 F3 色譜分析的問題（圖 3）。縮短孵育時間后，無需在孵育緩沖液中添加疊氮化鈉。此外，RINTDF 使用更高濃度的 PAA 和 AMG 進行孵育，除低聚異麥芽糖之外，所有不可消化的寡糖的 SDFS 測定值與 AOAC 方法 2009.01 測得的結果相同（表 2）。用試管中的樹脂對樣品中的大部分鹽分進行脫鹽處理，然后使用 Bio-Rad 的 HPLC 去離子預柱實現完全去離子，HPLC 的樣品制備也得以簡化。
圖 1：AOAC 方法 2009.01 和 2017.16 的總膳食纖維檢測流程。
圖 2：根據 AOAC 方法 2009.01 和 2017.16 進行孵育后的“Uncle Ben’s ReadyRice”中的SDFS 組分在 TSKgel® G2500PWXL色譜柱上生成的高效液相色譜圖。
圖 2：根據 AOAC 方法 2009.01 和 2017.16 進行孵育后的“Uncle Ben’s ReadyRice”中的SDFS 組分在 TSKgel® G2500PWXL色譜柱上生成的高效液相色譜圖。請注意，根據 AOAC 方法 2009.01 進行孵育后的 SDFS 中存在七糖，而根據AOAC 方法 2017.16 進行孵育后的 SDFS 中不存在七糖。
表 1：比較使用 AOAC 方法 2009.01（全組分總膳食纖維檢測程序）和 AOAC方法 2017.16（RINTDF 檢測程序）檢測一系列樣品測得的總膳食纖維值。
表 2：原始樣品以及依照 AOAC 方法 2009.01 和 AOAC 方法 2017.16（RINTDF檢測程序）進行孵育后的樣品中的 DP≥3 的寡糖回收率。
*一種菊粉三糖含量較高的 Raftilose P-95 樣品。
表 2：原始樣品以及依照 AOAC 方法 2009.01 和 AOAC 方法 2017.16（RINTDF檢測程序）進行孵育后的樣品中的 DP≥3 的寡糖回收率。
*一種菊粉三糖含量較高的 Raftilose P-95 樣品。
圖 3：依照 RINTDF 程序對 200mg Raftilose P-95 和 100mg 丙三醇進行孵育后所得 SDFS 組分在 TSKgel® G2500PWXL色譜柱上生成的 HPLC 色譜圖。
A. 原理：
A. 原理：
本手冊介紹了一種用于測定所有食品和食品原料中總膳食纖維（包括 DP≥3 的抗性淀粉SDFP（即不可消化的寡糖））的快速全組分檢測程序（RINTDF）。RINTDF 結合了 AOAC 官方方法2002.02、985.29、991.43、2001.03 和 2009.01的關鍵屬性。將兩份檢樣分別置于 250mL 密封瓶中，在胰 α-淀粉酶（PAA）和淀粉葡萄糖苷酶（AMG）的作用下，37°C 下攪拌或振蕩孵育 4 個小時（圖 4 和圖 5，第 19 頁）。在這一步驟中，非抗性淀粉被溶解并水解成 D-葡萄糖和痕量的麥芽糖。將 pH 值調節(jié)至 8.2（AMG 無活性），然后將孵育混合物加熱至 95℃左右，使 AMG 和 PAA 失活，從而終止反應。樣品中的蛋白質變性，并被蛋白酶水解。特定膳食纖維組分的測定方法如下：
i. 總高分子量膳食纖維（HMWDF）和 SDFS 的測定向孵育混合物中加入 4 倍體積的 95%乙醇并攪拌，孵育混合物中的 SDFP 形成沉淀，然后對懸浮液進行過濾。將在坩堝中回收的 HMWDF（由不溶性膳食纖維（IDF）和 SDFP 組成）洗滌、干燥并稱重。用蛋白質、灰分和空白值對殘渣質量進行修正后，進行最終計算。將過濾后的清液濃縮、去離子處理后，用HPLC 法分析 SDFS。
設備要求：
ii. 不溶性膳食纖維（IDF）、SDFP 和 SDFS 的測定
將孵育混合物水溶液進行過濾，以回收 IDF，并對濾渣進行洗滌、干燥和稱量。使用酒精或工業(yè)基化酒精（IMS）沉淀濾液中的 SDFP，然后對沉淀物進行回收、干燥并稱重。用蛋白質、灰分和空白值對 IDF 和 SDFP 殘渣質量進行修正，并最終計算 IDF 和 SDFP 的質量。已沉淀并去除 SDFP 的乙醇溶液濾液（即含SDFS 的濾液），依次經過濃縮和去離子處理后，用 HPLC 法進行分析。這些方法中使用的酶純度非常高；不含可分解 β-葡聚糖、果膠和阿拉伯木聚糖的雜質酶（表 3）。低聚果糖和低聚半乳糖等不可消化的寡糖（NDO）不會被水解（表 2），Polydextrose®的水解度與供應商提供的信息一致。
表 3：分析質控樣品，以確保使用的酶活力合適，且不存在雜酶活力（質控樣品可在 Megazyme 的 K-TDFC 試劑盒中獲�。φ辗治鰬灤┱麄�檢測程序。
4 號瓶：（x2）
5 號瓶：
a . 檢測過程中不應存在這一酶活力。
b . 檢測過程中，這一酶活力應當充分發(fā)揮作用。
c . 造成數值較低的主要原因是樣品中的水分含量。在孵育過程中不添加酶的情況下，也可獲得相近數值。
d . .這類物質含有大量抗酶解淀粉。這一膳食纖維值高于 AOAC 方法 991.43 的測定值（29.3%）。
試劑盒：
1 號瓶：（×2）
純化 PAA（40 KU/g）和 AMG（17 KU/g）混合物；5.2g。儲存在低于-10℃的干燥環(huán)境下可穩(wěn)定 5 年以上。
注意：粉末狀的酶混合物可能導致一些人嚴重過敏。因此，酶混合物的稱重和處理必須在通風柜中進行；請參[C(d)]。
2 號瓶：
純化蛋白酶（E-BSPAMS）（10.5 mL 3.2 M 硫酸銨溶液，350 酪氨酸 U/mL）。在 4℃下可穩(wěn)定 3 年以上。
3 號瓶：
液相色譜保留時間標準品【麥芽糊精與麥芽糖（比例4:1）】，約 5 g。
可穩(wěn)定 3 年以上；應置于室溫下密封保存。
4 號瓶：（x2）
丙三醇標準溶液（100 mg/mL，55 mL）。
在 4°C 下可穩(wěn)定 4 年以上；應置于 4°C 下密封保存。
5 號瓶：
D- 葡萄糖 / 丙三醇（ Glu/Gly ）標準溶液（均為 10mg/mL，溶解于 0.02%（w/v）疊氮化鈉中）。在 4 °C下可穩(wěn)定 4 年以上；應置于 4 °C 下密封保存。
B.
設備要求：
a. 磨碎機——離心磨碎機，12 齒轉子，篩網孔徑為 0.5 mm，或類似設備。作為替代方案，小劑量實驗室試樣也可使用旋風磨碎機磨碎，前提是磨碎機氣流充足或者采用其他冷卻措施來避免樣品過熱。
b. 消化瓶——250 mL Fisherbrand®蘇打玻璃寬口瓶，聚乙烯瓶蓋（貨號：FB73219）。
c. 燒結玻璃坩堝——古氏玻璃坩堝，燒結底盤，Pyrex® 50 mL，大孔徑，美國材料與試驗協會（ASTM）40-60 mm，Corning®型號 32940-50C。
依照以下步驟為每個樣品準備四個坩堝：
i. 將坩堝在馬弗爐中 525 ℃灼燒過夜，將馬弗爐冷卻至 130 ℃，取出坩堝，避免坩堝破裂。
ii. 使用真空抽力，清除任何殘留的 Celite®硅藻土和灰分。
iii. 將坩堝置于 2 %的清潔溶液[C(o)]中，室溫浸泡 1 小時。
iv. 用水和去離子水沖洗坩堝。
v. 最后用 15 mL 丙酮沖洗坩堝，空氣干燥。
vi. 在已干燥的坩堝中加入約 1.0 g Celite®硅藻土，并在 130 ℃下干燥至恒重。
vii. 將坩堝置于干燥器中冷卻約 1 小時，記錄裝有 Celite®硅藻土的坩堝質量。
d. 過濾燒瓶——1 L 厚壁布氏側臂燒瓶（圖 6，第 19 頁）。
e. 橡膠環(huán)連接器——用于連接坩堝和過濾燒瓶（圖 6，第 19 頁）。
d. 過濾燒瓶——1 L 厚壁布氏側臂燒瓶（圖 6，第 19 頁）。
e. 橡膠環(huán)連接器——用于連接坩堝和過濾燒瓶（圖 6，第 19 頁）。
f. 真空源——真空泵或可調節(jié)真空度的抽氣機（例如，Edwards XDS 10；單相 115/230V；產品代碼：A726-01-903）。
g. 水浴裝置——在浸入式熱水�。ɡ� Lauda Alpha®）中，放置一個 2 mag Mixdrive 15®潛水式磁力攪拌器，用 30×7 mm 攪拌子以 170 rpm 轉速攪拌（圖 4，第 19 頁）�；蚩刹捎么笕萘浚�20-24 L）帶蓋振蕩水浴槽（150rpm），溫度可維持在 37±1 °C 和 60±1 °C（例如 Grant® OLS 200 振蕩水浴槽）（圖 5，第 19 頁）。
h. 天平——最小分度值、準確度和精度均為 0.1 mg。
i. 烘箱——兩臺機械對流式烘箱，溫度設定為 105±2 ℃和 130±3 ℃。
j. 計時器。
k. 干燥器——氣密干燥器，裝有硅膠或等效干燥劑。每兩周將干燥劑置于烘
箱中在 130℃下干燥過夜。
l. pH 計。
m. 正位移移液器——例如 Eppendorf Multipette®-帶 25 mL Combitip®移液管（用于移取 5 mL PAA/AMG 溶液，3 mL 0.75 MTris 堿溶液和 4 mL 2M 乙酸溶液）。
-帶 5.0 mL Combitip®移液管（用于移取 0.1 mL 蛋白酶溶液）。
n. 分液器——用于移取 15±0.5 mL 78%（v/v）乙醇（或 IMS）、95%（v/v）乙醇、丙酮，以及 35±0.2 mL 緩沖液。
o. 量筒——100 mL 和 500 mL 刻度量筒。
p. 磁 力 攪 拌 器 和 攪 拌 子 ——7×30 mm ， 光滑表面磁力攪拌子 ， VWR International，型號 442-0269。
q. 橡膠刮刀——VWR International，型號 53801-008（圖 6，第 19 頁）。
r. 馬弗爐——525±5 °C。
s. 聚 丙 烯 試 管 ——Sarstedt 聚丙烯試管 ， 13 mL ， 101×16.5 mm （ 型 號 60.541.685）。
t. 液相色譜儀——烘箱可將柱溫維持在 80 ℃，配 50 μL 進樣環(huán)。液相系統必須能夠分離麥芽糖和麥芽三糖。
u. 保護柱（或預柱）——TSK®保護柱 PWXL 6.0 mm 內徑×4 cm（Tosoh Corp.，型號 TSKgel® G2500PWXL）。
v. 陽離子和陰離子交換保護柱（去離子柱）——陽離子和陰離子交換保護柱，分別為 H +和 CO2 3-型（Bio-Rad Laboratories，型號 125-0118，包括一個陽離子柱和一個陰離子柱），以及一個保護柱支架（Bio-Rad Laboratories，型號125-0139），以支撐兩個保護柱，陽離子柱在前，陰離子柱在后[14]（圖 7，第 19 頁）。
w. 液相色譜柱——兩個串聯的液相色譜柱。TSKgel® G2500PWXL，7.8 mm 內徑×30 cm（Tosoh Corp）；流速為 0.5 mL/min；柱溫 80 ℃；運行時間為 60分鐘，以確保樣品全部流出色譜柱（圖 8，第 20 頁）。
x. 檢測器——折光率（RI）檢測器；溫度維持在 50 ℃。
y. 數據集成器或計算機——用于測量峰面積。
z. 一次性注射器的濾膜——Millipore Millex®針頭式過濾器，孔徑為 0.45 μm（低蛋白結合 Durapore PVDF 濾膜），直徑為 25 或 13 mm，或其它等效濾膜。
aa. 濾水濾膜——Millipore，孔徑 0.45 μm 的 Durapore® HVLP 型濾膜，直徑為47 mm。
bb. 過濾裝置——支持直徑為 47 mm、孔徑為 0.45 μm 的濾膜[B(aa)]；可并過濾更大量的水。
cc. 注射器——一次性 10 mL 塑料注射器。
dd.. 液相色譜上樣針——Hamilton® 100 μL 710SNR 上樣針。
ee. 旋轉蒸發(fā)器——Heidolph Laborota® 4000 型或等效儀器。
ff. 微量離心機——轉速可達 13000 rpm。
gg. 溫度計——最高測量溫度至少為 110 °C。
試劑：
C.
試劑：
a. 乙醇（或 IMS）95%（v/v）。
b. 乙醇（或 IMS）78%（v/v）——將 180 mL 去離子水倒入一個 1 L 的容量瓶中。用 95%（v/v）乙醇（或 IMS）稀釋定容至刻度線，攪拌均勻。
c. 丙酮，試劑級。
d. PAA/AMG 儲備液——PAA（4 KU/5mL）和 AMG（1.7 KU/5mL）。將 1.0g PAA/AMG 粉末混合物（1 號瓶，第 6 頁）添加至 50 mL 馬來酸鈉緩沖液[C(g)]中，在磁力攪拌器上攪拌 5 分鐘，臨用現配。使用時置于冰上，并于制備后 4 小時內使用。
注意 1：如果分析員對粉末狀 PAA 和/或 AMG 過敏，應由一位對粉末混合物不過敏的分析員按照以下步驟將酶粉制備為硫酸銨懸浮液：將 5 gPAA/AMG 粉末混合物（PAA 40 KU/g 和 AMG 17 KU/g，1 號瓶，第 6 頁）緩慢添加至裝有 70 mL 冷蒸餾水的 200 mL 燒杯中，置于通風柜中磁力攪拌，直至酶粉完全溶解（約 5 分鐘）。
加入 35 g 顆粒硫酸銨，攪拌溶解。用硫酸銨溶液（50 g/100 mL）定容至100 mL。在 4 ℃下可穩(wěn)定 3 個月。
e. 溶解于 3.2M 硫酸銨溶液中的蛋白酶（50 mg/mL；350 酪氨酸 U/mL）——直接使用 2 號瓶（第 6 頁）內容物。使用前輕輕旋動內容物，使懸浮物質均勻分布。蛋白酶必須不含 α-淀粉酶，基本不含 β-葡聚糖酶和 β-木聚糖酶。使用時置于冰上。在 4℃下可穩(wěn)定 3 年以上。
f. 去離子水。
g. 馬來酸鈉緩沖液——50 mM、pH 6.0 加上 2 mM CaCl2。將 11.6 g 馬來酸溶解于 1600 mL 去離子水中，用 4 M（160 g/L）NaOH 溶液調節(jié) pH 至 6.0。加入 0.6 g 二水氯化鈣（CaCl2.2H2O），溶解并定容至 2 L。將溶液保存在密封良好的 Duran®瓶中，加入兩滴甲苯以防止微生物污染。在 4 °C 下可穩(wěn)定約 1 年。
h. 0.7 5M Tris 溶液——將 90.8 g Tris 緩沖鹽（Megazyme 貨號 B-TRIS500）溶解于約 800 mL 去離子水中。將 pH 值調節(jié)至 11，并定容至 1 L。室溫下可穩(wěn)定約 1 年。
i. 2 M 乙酸溶液——將 115 mL 冰乙酸（Sigma W200611-1KG-K）加入到 1 L的容量瓶中。用去離子水稀釋定容至 1 L。室溫下可穩(wěn)定 1 年以上。
j. 疊氮化鈉溶液（0.02%（w/v））——將 0.2 g 疊氮化鈉添加至 1 L 去離子水中，攪拌溶解。
注意 2：不得將疊氮化鈉加至低 pH 溶液中，疊氮化鈉酸化會釋放有毒氣體。處理疊氮化鈉前應仔細閱讀安全數據表（SDS），使用時應穿戴適當的個人防護設備，在實驗室通風柜中小心處理。
室溫下可穩(wěn)定 4 年以上。
k. 用于測定 HPLC 響應因子的 D-葡萄糖/丙三醇標準溶液——均為 10 mg/mL，溶液為 0.02%（w/v）疊氮化鈉。直接使用 5 號瓶（第 6 頁）內容物。
在 4 ℃下可穩(wěn)定 4 年以上。
l. 丙三醇（TSK®凝膠滲透色譜柱內標物）——100 mg/mL，含 0.02%（w/v）疊氮化鈉。直接使用 4 號瓶內容物（第 6 頁）。
在 4 ℃下可穩(wěn)定 4 年以上。
m. 液相色譜保留時間標準品——標準品中玉米糖漿干粉寡糖（DP>3）（DE25；日本兵庫縣伊丹市松谷化學；（www.matsutani.com））與麥芽糖的比例為 4:1（w/w）。稱取 2.5 g 混合物（3 號瓶，第 6 頁）溶解于 80 mL 0.02 %疊氮化鈉溶液中，定量轉移至一個 100 mL 的容量瓶中。用移液器移取 10mL 內標物溶液[C(l)]至容量瓶中，并用 0.02 %疊氮化鈉溶液[C(j)]定容至100 mL，將溶液分裝到 50 mL 的聚丙烯瓶中。室溫下可穩(wěn)定 1 年以上；在-10°C 以下可穩(wěn)定 4 年以上。
n. pH 標準液——pH 值為 4.0、7.0 和 10.0 的緩沖溶液。
o. 清潔溶液——Micro-90®（美國 International Products Corp.，貨號 M-9033，www.ipcol.com/shopexd.asp?id=15）。用去離子水配制 2 %的清潔溶液。
p. 陽離子交換樹脂——Amberlite® FPA53 (OH- )樹脂（Megazyme 貨號：G-AMBOH），離子交換容量不小于 1.6 meq/mL（制造商提供的 R-OH-交換容量數據）
q. 陰 離 子 交 換 樹 脂 ——Ambersep®200 (H+ ) 樹脂或 其 它 等 效 產 品 ， （Megazyme 貨號：G-AMBH），離子交換容量：不小于 1.6 meq/mL（制造商提供的 R-H+交換容量數據）。
r. Celite®硅藻土——預酸洗和預灰化處理的硅藻土（Megazyme 貨號：G-CELITE）。
D.試樣制備：
采集和制備的樣品應當是可以直接食用的形態(tài)，例如，烘焙粉應制作成食物并烤熟，意大利面應煮熟。如果脂肪含量>10%，則應依照 AOAC 985.29 進行脫脂處理。對于含水量較高（>25%）的樣品，最好是進行冷凍干燥。稱取約 50 g樣品置于磨碎機[B(a)]中磨碎，過 0.5 mm 篩網，將所有樣品轉移至一個寬口塑料罐中，通過振蕩和顛倒搖晃混合均勻。加入干燥包后儲存。
E. 酶純度：
為保證不含雜酶，且獲得理想的酶活力，若酶已經儲存 12 個月以上，需用標準品驗證酶的有效性（Megazyme 貨號 K-TDFC）。
F. 樣品的酶解：
(1)空白
在每組檢測中，對每個樣品配置兩個空白，以測量試劑對殘渣質量的貢獻值。
(2)樣品
(a) 準確稱取約 1 g 樣品，精確至小數點后第三位。一式兩份，分別裝入兩個250 mL 的 Fisherbrand®玻璃瓶中[B(b)]。記錄稱得的質量。
(b) 添加酶——用 1.0 mL 的 95%乙醇（或 IMS）[C(a)]浸潤樣品，然后加入 35mL 馬來酸鈉緩沖液[C(g)]，兩瓶樣品進行相同操作。蓋上瓶蓋，將樣品瓶置于 Grant OLS 200 振蕩孵育器（或類似儀器）[B(g)]中，用彈簧或聚丙烯支架將玻璃瓶固定在搖床上（圖 5，第 19 頁）。平衡 5 分鐘，使溶液溫度達到水浴溫度�；蛘�，使用一個 2 mag Mixdrive 15®浸沒式磁力攪拌器[B(g)]，用 7×30 mm 攪拌子[B(p)]攪拌（圖 4，第 19 頁）。
(c) 用 PAA/AMG 溶液孵育——加入 5 mL PAA/AMG 溶液[C(d)]，蓋上瓶蓋，將樣品瓶置于振蕩水浴槽中，37℃、150rpm 振蕩孵育[B(g)]4 小時整�；蛘呤褂� 2 mag Mixdrive 15®浸沒式磁力攪拌器以 170 rpm 轉速（確保顆粒完全離底懸浮）攪拌 4 小時整。注意：若使用酶制劑的硫酸銨懸浮液[C(d)]，則應添加 2 mL 酶懸浮液和 3 mL 馬來酸鈉緩沖液[C(g)]。
(d) 將 pH 值調節(jié)至約 8.2（pH7.9-8.4），使 α-淀粉酶和 AMG 失活——4 小時后，從振蕩水浴槽中取出所有樣品瓶，并立即加入 3.0 mL 的 0.75 M Tris 緩沖液[C(h)]，以終止反應（同時，如果只有一個水浴槽，則應將水浴槽溫度調高至 60 ℃，為蛋白酶孵育步驟做好準備）。略微擰松樣品瓶瓶蓋，并立即將樣品瓶置于 95 ℃至 100 ℃的水浴槽中（不振蕩），孵育 20 分鐘，期間偶爾用手振搖。使用溫度計確保樣品瓶內容物的最終溫度高于 90 ℃（僅檢查一個樣品瓶的溫度即可）。
(e) 冷卻——佩戴隔熱手套，將所有樣品瓶從沸水浴中取出，并置于 60 ℃的水浴槽中，讓溫度在 10 分鐘內平衡至約 60 ℃。
(f) 蛋白酶處理——用正位移液器加入 0.1 mL 蛋白酶懸液（2 號瓶，第 6 頁）[C(e)]（溶液較為粘稠），60 ℃孵育 30 分鐘。
(g) 調節(jié) pH——向兩個樣品瓶中分別加入 4.0 mL 的 2M 乙酸[C(i)]并混合均勻，以調節(jié) pH 值。最終 pH 值約為 4.3。
(h) 內標物——分別加入兩個樣品瓶中加入 1.0 mL 丙三醇內標物溶液（100mg/mL；4 號瓶，第 6 頁）[C(l)]，并混合均勻。
(i) 執(zhí)行步驟[G(a)]以測定 HMWDF（IDF+SDFP），或者執(zhí)行步驟[H(a)]以測定 IDF、SDFP 和 SDFS。
注意：
如需測定可利用碳水化合物，準確轉移 0.5 mL 孵育溶液至一微量離心管中，13000 rpm 離心 3 分鐘。轉移 0.2 mL 上清液至一 13 mL（101×16.5mm）聚丙烯試管中，并添加 5 mL 蒸餾水。蓋上試管蓋，于-10°C 以下保存。使用Megazyme 可利用碳水化合物測定試劑盒（K-AVCHO）進行可利用碳水化合物分析。
G. 測定 HMWDF（IDF 和 SDFP）：（與 AOAC 方法 2009.01 的程序相同）：
(a) 沉淀 SDFP——將樣品預熱至 60 ℃，加入 220 mL 95 %（v/v）乙醇或IMS[C(a)]（在室溫下量取，預熱至 60 ℃）�；旌暇鶆�，室溫沉淀 60 分鐘（也可過夜沉淀）。
(b) 準備過濾——稱量裝有 Celite®硅藻土[B(c)]的坩堝重量，精確到 0.1 mg。用洗瓶操作，用 15 mL 78 %（v/v）乙醇或 IMS[C(b)]浸潤并重新分配坩堝中的 Celite®硅藻土層。用適度的抽力將坩堝中的 Celite®硅藻土平整地分布于燒結玻璃底盤上（圖 6，第 19 頁），倒掉濾液。
(c) 過濾——利用真空抽力，用坩堝過濾沉淀的酶消化物[G(a)]。使用一個裝有78 %（v/v）乙醇或 IMS 的洗瓶，將所有殘余酶消化物定量轉移至坩堝中，并用 15 mL 78 %（v/v）乙醇（或 IMS）[C(b)]洗滌殘渣。保留濾液和洗液，并用 78 %乙醇定容至 300 mL，然后執(zhí)行第 16 頁的步驟[I(a)]，以測定SDFS。
(d) 洗滌——利用真空抽力，依次用 15 mL 以下溶液洗滌殘渣兩次：78 %（v/v）乙醇（或 IMS）[C(b)]、95 %（v/v）乙醇（或 IMS）[C(a)]和丙酮[C(c)]。倒掉洗滌液，繼續(xù)用真空泵抽至少 2 分鐘，以確保在將坩堝置于烘箱干燥之前已清除所有丙酮。
(e) 干燥坩堝——將裝有殘渣的坩堝置于 105 ℃烘箱中，干燥過夜。若使用強風型烘箱，則應用鋁箔松散覆蓋住坩堝口，以防止樣品損失。
(f) 將坩堝置于干燥器中冷卻約 1 小時。稱量坩堝重量（包含膳食纖維殘渣和Celite®硅藻土），精確到 0.1 mg。將稱得的質量減去坩堝和 Celite®硅藻土的質量，即得殘渣質量。
(g) 蛋白質和灰分的測定——取其中一個坩堝的殘渣用于分析蛋白質，另一個坩堝的殘渣用于分析灰分。用凱氏定氮法（Kjeldahl）或燃燒法對殘渣進行蛋白質分析（使用燃燒法分析儀時務必小心。樣品中揮發(fā)出的 Celite®硅藻土可能堵塞分析儀的傳輸管）。在所有情況下均應使用 6.25 作為系數來計算蛋白質質量。將另一份殘渣在 525 °C 馬弗爐[B(r)]中灼燒 5 個小時，于干燥器中冷卻，并稱重至 0.1 mg，減去坩堝和 Celite®硅藻土的質量，即得灰分質量。
(h) 計算 HMWDF（IDF+SDFP）和 SDFS 質量——執(zhí)行步驟[J]（第 17 頁）。
H. 分別測定 IDF 和 SDFP：（與 AOAC 方法 2011.25 的程序相同）：
IDF
(a) 準備過濾——稱量裝有 Celite®硅藻土[B(c)]的坩堝重量，精確到 0.1 mg。用洗瓶操作，用 15 mL 78 %（v/v）乙醇或 IMS[C(b)]浸潤并重新分配坩堝中的 Celite®硅藻土層。用適度的抽力將坩堝中的 Celite®硅藻土平整地分布于燒結玻璃底盤上（圖 6，第 19 頁），倒掉濾液。
(b) 過濾——利用真空抽力，用坩堝過濾步驟[F(2)(a)]的酶消化物。使用一個裝有 60 ℃去離子水的洗瓶，用最少量（約 10 mL）的水沖洗孵育瓶，并使用一個橡膠棒（或鏟）[B(q)]輔助轉移容器內壁上的所有顆粒。將懸浮液轉移至坩堝中，再次用 10 mL 60 ℃的水洗滌孵育瓶，并將懸浮液轉移至坩堝中。收集濾液和洗滌液，并定容至 70 mL，用于測定 SDFP[H(f)]和 SDFS[H(g)]。
(c) 洗滌——利用真空抽力，依次用 15 mL 以下溶液洗滌殘渣兩次：78 %（v/v）乙醇（或 IMS）[C(b)]、95 %（v/v）乙醇（或 IMS）[C(a)]和丙酮[C(c)]。倒掉洗滌液，繼續(xù)用真空泵抽至少 2 分鐘，以確保在將坩堝置于烘箱干燥之前已清除所有丙酮。
(d) 干燥坩堝——將裝有殘渣的坩堝置于 105 ℃烘箱中，干燥過夜。
(e) 冷卻坩堝和測定 IDF。冷卻坩堝，并依照步驟[G(e)]至[G(f)]測定殘渣質量。依照步驟[G(g)]測定蛋白質和灰分，并在殘渣質量中扣除蛋白質和灰分質量。依照步驟[J]計算 IDF（請參閱注意，第 16 頁）。
SDFP
(f) 沉淀 SDFP——將步驟[H(b)]獲得的各個樣品的濾液（約 70 mL）預熱至60 ℃，并添加 320 mL 95 %（v/v）乙醇或 IMS[C(a)]（在室溫下量取，再預熱至 60 ℃），并混合均勻。室溫沉淀 60 分鐘（也可過夜沉淀）。
(g) 過濾和回收 SDFP 和 SDFS——過濾懸浮液并回收殘渣，分析蛋白質和灰分，并依照步驟[G(b)]至[G(g)]計算 SDFP。保存濾液和洗滌液（約 420 mL），并執(zhí)行步驟[I(a)]來測定 SDFS。
I. 測定 SDFS：
注意：正確地去除溶液中的離子是獲取優(yōu)質色譜數據的必要條件。參閱圖 9（第 20 頁）以比較在存在和不存在緩沖鹽的情況下，丙三醇和 D-葡萄糖生成的色譜圖。為確保使用的樹脂具有充分的去離子能力，將 0.1 mL 蛋白酶懸浮液（2 號瓶，第 6 頁）添加至 40 mL 馬來酸緩沖液[C(g)]中，并加入 3.0 mL 0.75M Tris 堿溶液[C(h)]、4.0 mL 2 M 乙酸[C(i)]、1 mL 丙三醇內標物溶液（100
mg/mL；4 號瓶，第 6 頁）[C(l)]和 1 mL D-葡萄糖溶液（100 mg/mL），將混合溶液置于旋轉蒸發(fā)器上蒸干，用 32 mL 去離子水中復溶。取 5 mL 該溶液至一個 13 mL 的聚丙烯試管[B(s)]中，加入 1.5 g Amberlite® FPA53（OH-）樹脂和1.5g Ambersep® 200（H +）樹脂（圖 8，第 20 頁），蓋上管蓋，并顛倒搖晃試管，持續(xù) 5 分鐘。靜置使樹脂沉底，并使用注射器[B(cc)]取 1.5-2.0 mL 上清液，過 0.45 μm 聚偏氟乙烯膜[B(z)]。取 50 μL 上 TSK 色譜柱（已安裝去離子預柱）。應得到類似于圖 9c（第 20 頁）所示的色譜圖，即沒有明顯的鹽峰。
(a) 濾液回收和濃縮——【若需兩份 SDFS 數據，應將其中一份重復樣品的濾液[G(c)]或[H(g)]留存?zhèn)溆谩�。取第二份重復樣品的濾液[G(c)]或[H(g)]的四分之一【即~75 mL 的[G(c)]或~105 mL 的[H(g)]】，置于 500 mL 的旋轉蒸發(fā)瓶，60℃下真空蒸干，用 8 mL 去離子水復溶。
(b) 樣品去離子——將 5 mL 步驟[I(a)]中所得的樣品濃縮液轉移至一個 13 mL的聚丙烯試管[B(s)]中（樣品中含丙三醇內標物，因此無須定量轉移）。在試管中加入約 1.5 g Amberlite® FPA53（OH-）樹脂[C(p)]和 約 1.5 gAmbersep® 200（H +）樹脂[C(q)]，將試管顛倒搖晃 3 至 4 分鐘（圖 8，第20 頁）。
(c) 制備用于液相色譜分析的樣品——將溶液轉移至一個 10 mL 的一次性注射器[B(cc)]中，過 0.45 µm 濾膜[B(z)]。也可將 1 mL 溶液轉移至微量離心管[B(ff)]中，13000 rpm 離心 3 分鐘。用一個 100 μL 液相色譜玻璃上樣針[B(dd)]上 50 μL 樣至色譜儀[B(t)]。對樣品進行一次分析便已足夠。色譜柱：一根去離子預柱[B(v)]加兩根 TOSOH TSK 凝膠滲透色譜柱[B(w)]。溶劑：經微濾[B(bb)]的蒸餾水。流速：0.5 mL/min；每次運行 60 分鐘。溫度：80 °C（圖 7，第 19 頁）。
(d) 測定 D-葡萄糖的響應因子——由于 D-葡萄糖的液相色譜折光率（RI）響應因子與組成 SDFS 的不可消化的寡糖的響應因子相當，因此 D-葡萄糖被用來校準液相色譜儀，其響應因子也被用于計算 SDFS 質量。用一個 100 μL液相色譜上樣針將 50 μL 的 D-葡萄糖/丙三醇內標物溶液（5 號瓶，第 6 頁）上樣至液相色譜儀，做兩個平行。依照步驟[J(b)](1)]計算響應因子。
(e) 校準用于計算 SDFS 的峰面積——用一個 100 μL 液相色譜上樣針將 50 μL的保留時間標準品[C(m)]（3 號瓶；第 6 頁）上樣至液相色譜儀，做兩個平行。確定 DP2 和 DP3 寡糖（麥芽糖 vs 聚合度更高的寡糖）的分界點（圖 3，第 4 頁）。
(f) 確定樣品提取物色譜圖中 SDFS（PASDFS）和內標物（PAIS）的峰面積——將樣品提取物[I(c)]上樣至液相色譜儀。將 DP 高于 DP2/DP3 分界點的所有峰面積記錄為 PASDFS，將內標物的峰面積記錄為 PAIS。
(g) 執(zhí)行步驟[J(b)(2)]。
J. 計算總膳食纖維含量：HMWDF（IDF+SDFP）+SDFS
（a） HMWDF（IDF+SDFP）（重量分析法）
（a） HMWDF（IDF+SDFP）（重量分析法）
（1） 測定空白值（B，mg）
式中 BR1 和 BR2 分別為兩份重復空白樣測定的殘渣質量（mg）；PB 和 PA 為用
兩份空白殘渣分別測定的蛋白質和灰分質量（mg）。
圖 8：對用于 HPLC 分析的樣品進行去離子處理。5 mL 濃縮洗脫液與 1.5 g Amberlite® FPA53(OH- )樹脂和 1.5g Ambersep®200(H+ )樹脂混合。
圖 9：
（2） 測定 [IDF+SDFP]
式中 M1=樣品質量 1（g）；M2=樣品質量 2（g）；R1=M1的殘渣質量 1（mg）；R2=M2 的殘渣質量 2（mg）；PA=R1 的灰分質量（mg）；PB=R2 的蛋白質質量（mg）；B=測定的空白值[J(a)(1)]（mg）。
注意：單獨測定 IDF 和 SDFP 時也是使用上述公式。[參閱步驟 H(a)和 H(f)] 。
（b） SDFS（HPLC 法）
（1） 測定 D-葡萄糖響應因子
從兩份重復樣品的色譜圖中獲取 D-葡萄糖和內標物（丙三醇）的峰面積數值。D-葡萄糖與丙三醇的峰面積之比與 D-葡萄糖與丙三醇的質量之比的比率即“響應因子”。D-葡萄糖對丙三醇的響應因子約為 0.82。
響應因子（Rf）=
式中 PAGlu=D-葡萄糖峰面積；PAIS=內標物（丙三醇）峰面積；WtGlu=1 mL D-葡萄糖/丙三醇標準溶液中的 D-葡萄糖質量（10 mg）；WtIS=1mL D-葡萄糖/丙三醇標準溶液中的內標物（丙三醇）質量（10 mg）。
（2） 測定 SDFS
式中，Rf=響應因子；WtIS=過濾前加入到樣品中的 1 mL 丙三醇內標物溶液中的內標物質量（100 mg/mL，即 100 mg）；PASDFS=SDFS 組分的峰面積；PAIS=丙三醇內標物峰面積；M=兩份樣品中，濾液用于色譜分析的其中一份樣品的質量（M1或 M2），單位為 g。
（c）總膳食纖維
總膳食纖維（g/100g）=[IDF+SDFP]（g/100g）+SDFS（g/100g）
注意：可以使用 Megazyme Mega-CalcTM來簡化這些計算�？稍L問 Megazyme 網站（www.megazyme.com）下載 Megazyme Mega-CalcTM。
圖 4：置于定制水浴槽中的 2mag Mixdrive 15®浸入式磁力攪拌器�？稍� 37℃下 170 rpm同時攪拌 15 個樣品。
圖 5：Grant OLS 200®振蕩水浴槽，溫度設定為37 ℃，圖中為定制的適配 Fisherbrand®250 mL 玻璃瓶的聚丙烯支架。
圖 6：布氏燒瓶、坩堝、橡膠套筒和真空歧管裝置，用于過濾膳食纖維樣品。圖中還包括樣品瓶和玻璃棒上的橡膠刮刀。
圖 7：對采用 TSKgel® G2500PWXL 色譜柱進行色譜分析的樣品進行在線去離子處理。14
圖 9：
以下樣品在 TSKgel® G2500PWXL 色譜柱上生成的色譜圖
a) 未經去離子處理的 RINTDF 孵育緩沖液中的葡萄糖和丙三醇混合物；
b) 取與圖（a）相同的 5 mL 樣品，用 1.5 g Amberlite® FPA53 (OH- )和 1.5 gAmbersep® 200 (H+ )樹脂進行去離子處理（如圖 8 所示）；
c) 安裝去離子預柱后，樣品“b”在相同的 TSK 柱上生成的色譜圖 14。
RINTDF 檢測程序的實驗室間評估：
RINTDF 檢測程序的實驗室間評估：
本數據手冊中說明的 RINTDF 方法是 AOAC 方法 2009.01 的更新，解決了在過去 8 年里，分析師們在使用 AOAC 方法 2009.01 時面臨的諸多問題。本方法在美國官方分析化學家協會（AOAC International）和國際谷物科技協會（ICC）的組織下接受了實驗室間評估 15。
共有 13 個實驗室參與了本方法的實驗室間評估，所有實驗室都對 16 份檢樣（8份盲樣，每份兩個重復）中的大多數檢樣得出了有效檢測數據。檢樣由不同含量的傳統膳食纖維、抗性淀粉和不可消化的寡糖組成。8 對檢樣的膳食纖維含量范圍為 6.90 至 60.37 g/100g�？偵攀忱w維含量為采用重量分析法測定的 IDF加 SDFP 的質量，和采用 HPLC 法測定的 SDFS 的質量之和。
由于參考文獻 15 中所述的原因，在進行統計分析時，剔除了兩個實驗室的檢測結果。剩下 11 個實驗室的重復性標準偏差（Sr）范圍為 0.27 至 0.76 g/100 g，再現性標準偏差（SR）范圍為 0.54 至 3.99 g/100 g。相對重復性標準偏差（RSDr）范圍為 1.22 至 6.52 %，相對再現性標準偏差（RSDR）范圍為 2.14 至10.62 %（表 4）。這些統計值與采用其他膳食纖維檢測方法對類似樣品測得的結果一致 3。基于實驗室間評估的結果，RINTDF 方法經 AOAC 批準為方法2017.16，并經 ICC 批準為標準草案 185。
表 4：食品總膳食纖維的實驗室間研究結果（AOAC 方法 2017.16）。根據AOAC 統計數據格式進行統計評估。
樣品：A&D=磷酸酯交聯淀粉（Fibersym®）；B&F=花豆（清洗凍干的罐頭裝）；C&J=全谷麥片；E&H=含低聚果糖的脫脂餅干；G&N=燕麥麩；I&M=含葡聚糖和 RS2的脫脂餅干；K&O =黑麥薄脆餅干；L&P=全麥面包。
Sr：重復性；RSDr：相對重復性標準差；SR：再現性；RSDR：相對再現性標準差。
標簽：
快速全組分總膳食纖維檢測
K-RINTDF
