NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension

Keywords: extracellular traps; histones; hypertension; neutrophils; protein-arginine deiminase type 4.

高血壓是心血管疾病最重要的可改變危險(xiǎn)因素。中性粒細(xì)胞在先天免疫反應(yīng)中起重要作用，是人體循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞。在人類高血壓中，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。中性粒細(xì)胞還通過(guò)稱為 NETosis的過(guò)程形成中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（NETs）去殺死病原體。NETs 具有促炎性，并在許多疾病條件下的免疫激活和炎癥中發(fā)揮作用。在人類和嚙齒動(dòng)物高血壓模型中，腎臟和主動(dòng)脈等外周組織的 NETosis 增強(qiáng)，NETs 也存在于高血壓大鼠和小鼠模型的腸系膜血管中。此外，NETs 還促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成，并有助于血小板的活化。

肽酰精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）是一種位于中性粒細(xì)胞細(xì)胞核中的鈣依賴性酶，能催化瓜氨酸化組蛋白H3（H3-Cit）導(dǎo)致染色質(zhì)解聚，這是NETs形成的關(guān)鍵因素。H3-Cit 已被證明可以破壞微血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）屏障。

機(jī)械敏感鈣通道 TRPV4（瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道亞家族V 成員4）在中性粒細(xì)胞中高度表達(dá)。在急性肺損傷模型中，抑制 TRPV4 會(huì)減弱中性粒細(xì)胞 ROS 的產(chǎn)生、粘附和趨化性。用 TRPV4 激動(dòng)劑GSK1016790A處理中性粒細(xì)胞則以劑量依賴性方式增加 ROS 的產(chǎn)生。

基于這些發(fā)現(xiàn)，美國(guó)范德堡大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系、麻醉學(xué)系及醫(yī)學(xué)中心臨床藥理學(xué)部研究團(tuán)隊(duì)假設(shè) NETosis 導(dǎo)致 EC 激活和血管功能障礙，從而導(dǎo)致高血壓。觀察結(jié)果確定了 NETosis 在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。研究成果發(fā)表于Circulation Research 期刊題為“NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension”。



首先，為了確定 Padi4 在高血壓小鼠免疫細(xì)胞亞群中的表達(dá)，檢測(cè)了用血管緊張素II（Ang II）處理的小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Padi4 表達(dá)在中性粒細(xì)胞簇中富集，在其他細(xì)胞類型中低表達(dá)。為了確定 PAD4 在高血壓中的作用，用Ang II處理 Padi4−/−或 C57Bl/6 對(duì)照小鼠，測(cè)量收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓。Padi4−/− 小鼠在第 1 周發(fā)展為高血壓，并在接下來(lái)的 3 周內(nèi)表現(xiàn)出收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓的降低。這說(shuō)明，PAD4 的缺失減輕了 Ang II 誘導(dǎo)的高血壓。

為了評(píng)估 NETosis 對(duì)血管反應(yīng)性的作用，采集腸系膜動(dòng)脈并確定血管功能。結(jié)果未觀察到對(duì)硝普鈉的反應(yīng)差異，然而，Padi4−/− 小鼠對(duì)乙酰膽堿的反應(yīng)改善了血管松弛（圖1 A、B）。為了評(píng)估腎臟鈉和水含量，小鼠在Ang II 處理后注射生理鹽水注射，并測(cè)量尿量，發(fā)現(xiàn) Padi4−/− 小鼠腎臟鈉和容量排泄提高的趨勢(shì)（圖1 C）。此外，與C57Bl/6小鼠相比，Padi4−/− 小鼠的中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和細(xì)胞毒性 CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少（圖1 D-F）。這些結(jié)果表明，Padi4−/− 小鼠表現(xiàn)出內(nèi)皮依賴性血管松弛改善和主動(dòng)脈炎癥減少。
 

圖1 NET-缺陷小鼠對(duì)Ang II的反應(yīng)改善了內(nèi)皮細(xì)胞功能，減少了血管炎癥。

接下來(lái)，收集原代 C57Bl/6 中性粒細(xì)胞，與C57Bl/6 小鼠主動(dòng)脈 ECs共培養(yǎng)或單獨(dú)培養(yǎng) 18 小時(shí)。培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞暴露于正常血壓（5%）或高血壓（10%）單軸循環(huán)拉伸。在沒(méi)有 ECs 的情況下，10% 的拉伸會(huì)增加 NETosis。然而，在共培養(yǎng)后，與單獨(dú)培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞相比，當(dāng)以 5% 或 10% 的拉伸暴露于 ECs 時(shí)，中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出增加的 NETosis。與5% 拉伸或單獨(dú)培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞相比，10% 的拉伸以疊加效應(yīng)增強(qiáng)共培養(yǎng)中的 NETosis。此外，與 C57Bl/6 中性粒細(xì)胞相比，Padi4−/− 中性粒細(xì)胞與10% 拉伸暴露的 ECs 共培養(yǎng)導(dǎo)致最少的細(xì)胞外 DNA 分泌和 NET 形成。這表明，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)以及高血壓牽張暴露會(huì)增加 NETosis。

進(jìn)一步地，中性粒細(xì)胞與 ECs 共培養(yǎng) 36 小時(shí)。與單獨(dú)培養(yǎng)中性粒細(xì)胞相比，與ECs 共培養(yǎng)顯著提高了細(xì)胞存活率。驗(yàn)證在 ECs 存在下拉伸的效果，發(fā)現(xiàn)與 5% 的拉伸相比，10% 的拉伸增加了共培養(yǎng)中的 NETosis（圖2 A、B）。細(xì)胞活力評(píng)估顯示，與 5% 拉伸相比，10% 拉伸時(shí)自殺性 NETosis 增加（圖2 C、E）。
 

圖2 在內(nèi)皮細(xì)胞存在的情況下，長(zhǎng)期高血壓拉伸會(huì)增加自殺性 NETosis。

最后，收集與 ECs 共培養(yǎng)并暴露于 5% 或 10% 拉伸的中性粒細(xì)胞，通過(guò) Western blot 評(píng)估 H3-cit。與 5% 拉伸相比，暴露于 10% 拉伸的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出 H3-Cit 增加。此外，觀察到暴露于 H3-Cit 的 ECs 中 Icam1、Vcam1、Sell 和 Sele 的表達(dá)顯著增加。主動(dòng)脈環(huán)暴露于細(xì)胞外組蛋白 H3 或 H3-cit 減弱了響應(yīng)乙酰膽堿的血管松弛反應(yīng)。與暴露于對(duì)照的拉伸細(xì)胞相比，ECs 暴露于 10% 拉伸和 H3-Cit 顯著增加了炎性細(xì)胞因子 Il6、Tgfβ 和 Tnfα 的表達(dá)。這說(shuō)明，高血壓拉伸增加中性粒細(xì)胞H3-Cit，H3-Cit暴露導(dǎo)致 EC 激活、血管功能障礙和炎性細(xì)胞因子表達(dá)。

然后，為了確定機(jī)械敏感鈣通道 TRPV4 的激活是否會(huì)增加中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣水平，分離的小鼠中性粒細(xì)胞分別用1、10和100 nM的特異性TRPV4激動(dòng)劑 GSK1016790A處理。結(jié)果觀察到，GSK1016790A處理后細(xì)胞內(nèi)鈣呈劑量依賴性增加（圖3 A、B）。為了確定 TRPV4 激動(dòng)作用是否刺激 H3-Cit 產(chǎn)生和 NETosis，用 GSK1016790A 處理中性粒細(xì)胞，并通過(guò)免疫熒光評(píng)估 H3-Cit 和 NET 的形成，發(fā)現(xiàn) H3-Cit 和 NETosis 呈劑量依賴性增加，且在 100 nmol/L 時(shí)顯著增加（圖3 C-E）。這說(shuō)明，TRPV4 的激活增加中性粒細(xì)胞胞內(nèi)鈣水平并增加 NETosis。

圖3 中性粒細(xì)胞中的 TRPV4 激活可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)鈣和 NETosis。

圖4 圖形概要

總之，該研究表明 NETosis 會(huì)導(dǎo)致高血壓、主動(dòng)脈炎癥和高血壓中的 EC 功能障礙。此外，還表明內(nèi)皮細(xì)胞拉伸是高血壓的標(biāo)志，是 NETosis 的直接驅(qū)動(dòng)因素。鑒于 NETs 作為心血管疾病的重要因素，高血壓對(duì) NETosis 的影響可能有助于這些疾病的發(fā)展和進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：Krishnan J, Hennen EM, Ao M, Kirabo A, Ahmad T, de la Visitación N, Patrick DM. NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension. Circ Res. 2024 May 24;134(11):1483-1494. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.323897. Epub 2024 Apr 26. PMID: 38666386; PMCID: PMC11116040.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38666386/

IF：16.5

ISSN：0009-7330

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