采用酶標(biāo)法（ELISA）進行三聚氰胺檢測

本實驗方案采用Thermo Scientific的Multiskan MK3型酶標(biāo)儀和Wellwash 4MK2型洗板機（由北京平利洋公司提供），，結(jié)合Abraxis三聚氰胺檢測試劑盒，以競爭法測抗原的原理對液態(tài)奶或奶粉中的三聚氰胺進行檢測分析。

一、樣品準(zhǔn)備
巴氏消毒全脂奶（液體）：
1）用稀釋液以1:10的比例稀釋牛奶樣品，如在900 μl的稀釋液中加入100 μl牛奶。
嬰幼兒配方奶粉：
1）按照配方奶粉的說明，以稀釋液溶解奶粉，如用60 ml稀釋液溶解8.6克奶粉。
2）用稀釋液以1:5的比例稀釋奶粉溶液

二、樣品檢測
1）試劑使用前，應(yīng)使其溫度恢復(fù)至室溫（25±2℃）
2）吸取100 μl標(biāo)準(zhǔn)品（0, 20, 50, 100, 200和500 ppb）和準(zhǔn)備好的樣品加入相應(yīng)的微孔中。然后，每孔再加入50 μl的三聚氰胺HRP酶標(biāo)記物。
3）利用MK3酶標(biāo)儀的振蕩功能，振板60秒，并在室溫下孵育30分鐘。
4）孵育完后，將微孔板轉(zhuǎn)移到Wellwash 4MK2洗板機上進行洗板，每孔加250 μl洗液，洗板四次。
5）每孔加入100 μl顯色底物溶液，避光孵育20分鐘。
6）每孔加入100 μl終止液，終止顯色反應(yīng)。
7）在MK3酶標(biāo)儀上讀板，測量波長450nm。

三、結(jié)果分析
1）以濃度為0 ppb標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值為基準(zhǔn)（B0），歸一化標(biāo)準(zhǔn)品的檢測吸光值B/B0（B指除B0以外的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值）。
2）繪制以標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0為Y軸坐標(biāo)、對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸坐標(biāo)的散點圖。
3）對該散點圖進行直線擬合。以該擬合曲線的直線方程對待測樣品濃度進行計算。
4）如果樣品吸光值大于最小標(biāo)樣的吸光值，則該樣品的濃度＜20 ppb；如果樣品吸光值小于最大標(biāo)樣的吸光值，則樣品的濃度＞500 ppb。
5）結(jié)合稀釋倍數(shù)，計算最終液態(tài)奶或奶粉中的三聚氰胺濃度，如液態(tài)奶稀釋倍數(shù)是10倍。